DNA的重组操作课件.ppt

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1、第六章DNA的重组操作第一节DNA的体外重组基因重组是信赖于工具酶的作用，将外源目的片段和体DNA连接在一起，再转入到受体胞，实现目的基因在受体细胞内的正确表达。一、黏性末端DNA分子间的连接（一）同种RE黏性末端间的连接单酶切黏性末端连接优点:是操作简单，外源片段易于回收不足：易自连、不定向克隆、重组率低、重组体类型多、筛选难度大（二）不同RE黏性末端间的连接可实现个源片段的定向插入无载体自连直接用T4连接酶连接，但效率低给平齐末端DNA分子加尾，再用DNA连接酶进行连接。常用的平齐末端DNA片段连接法有同聚物加尾法、衔接物连接

2、法及接头连接法。二、平末端的连接原理：末端脱氧核苷酸转移酶能将一种脱氧核苷酸加到DNA分子的3’-OH上，便构成由同一种核苷酸组成的多聚核苷酸尾巴。当两种DNA分子带有可互补配对的poly尾巴时，能彼此连接起来，此种连接方式称为同聚物加尾法。1.同聚物加尾法AB+5’3’5’3’5’末端特异的核酸外切酶处理形成延伸末端5’3’5’3’dATPdTTP末端转移酶末端转移酶A(An)AA(An)A5’3’5’T(Tn)T3’T(Tn)TA(An)AT(Tn)TT(Tn)TA()A转化到大肠杆菌细胞内同聚物加尾法示意图所谓衔接物（lin

3、ker)是指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成具有一个或数个限制酶识别位点的平齐末端的双链寡聚核苷酸片段。2.衔接物连接法+GGATCCCCTAGG5’3’BamHI衔接物连接酶GGATCCCCTAGGCCTAGGGGATCCBamHI酶切GCCTAGGATCCG5’3’3’5’+GGGATCCCCTAGBamHI酶切后的载体连接酶CCTAGGGGATCCGGATCCCCTAGG衔接物连接法示意图3.接头连接法为了克服衔接物连接法的不足，而直接在平齐末末端加上一种RE的粘性末端即DNA接头（adapter)的连接方法。体

4、外连接的DNA分子必须尽快引入寄主细胞，否则很快降解,而且只有导入寄主细胞中进行繁殖才能获得大量的单一的重组体分子。第二节重组DNA分子向寄主细胞的导入受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)重组DNA导入受体菌转化(transformation)严格是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。转染（transfection)是专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体载体DNA分子

5、的生命过程。一、细菌转化的原理F.Griffith1928年，　研究脑炎球菌时发现Avery1928年，　研究脑炎球菌时发现1.细菌转化的发现在自然界同样观察到，枯草杆菌，流感嗜血杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌等发现转化现象。一.细菌转化的原理凡是能吸收游离DNA片段的细菌称为感受态细菌或者说处于感受态2.感受态一.细菌转化的原理分泌感受态因子小蛋白而导致感受态的形成3.革兰氏阳性细菌的转化过程双链DNA与细菌结合单链DNA分子的吸收（另一链降解）一种特殊Pro包在单链DNA分子上，使其免遭核酸酶的降解E.Coli不产生感受态因子，它的感

6、受态需诱导4.革兰氏阴性细菌的转化过程0℃度时Ca2＋处理细胞，辅以短时间的热冲激可得到感受态Ca2＋可能改变细胞壁，使细胞成为原生质团；另外它有助于DNA形成羟基磷酸钙复合物，刺激细胞对DNA的吸收DNA进入细胞后的稳定性环状＞线型质粒　因为环状分子可抵抗外切酶的作用，同时线性分子必须转变为环状才能复制5.影响转化效率的因素DNA的浓度和纯度质粒的大小大质粒转化效率低，＞15kb难以转化5.影响转化效率的因素载体分子与插入片段间无效连接DNA进入细胞的稳定性，环化>线性质粒的大小大<小寄主细胞的浓度pH,培养时间，热冲击时间，平

7、板培养二.常用的转化方法经典的CaCl2转化方法离心CaCl2溶液重悬细胞对数成长期的Ecoli冰浴冰浴感受态细胞42OC热激电激转化法对数成长期的Ecoli离心H2O重悬细胞冰置冰置感受态细胞离心并以H2O重悬浮细胞电激第三节重组转化体的筛选与鉴定筛选重组体可通过直接或间接的手段直接的手段质粒DNA的提取和限制性酶切分析质粒DNA与分子杂交间接的手段包括观察是否有表型变化的重组体。联合运用直接和间接的手段直接选择法：抗药性标记选择，插入失活法标志补救如α互补分子杂交法原位杂交Southern印迹非直接选择法：免疫学方法如免疫化学

8、方法酶免检测法重组体的筛选插入失活法α互补的检测原位杂交Southern印迹