《重组DNA》PPT课件

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1、11重组DNA技术11.1重组DNA技术是基因工程的核心技术11.2获得需要的目的基因（外源基因）11.3构建重组质粒和基因克隆11.4转化受体细胞和转化子的筛选11.5转化子的分析——Southern杂交重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。所谓基因工程(geneticengineering)就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要

2、的产物。11.1重组DNA技术是基因工程的核心技术生物技术获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(genelibrary)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。11.2获得需要的目的基因（外源基因）细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建细胞内总DNA的提取分离程序反转录人工合成互补DNA构建基因文库获取目的基因存在的问题——费时费事内含子序列以mRNA为模板，以短的寡核苷酸（oligo(dT)

3、）分子作引物，加入dATP,dTTP,dGTP和dCTP,oligo(dT)与mRNA分子的多聚A（polyA）尾巴碱基配对，在逆转录酶的作用下，根据碱基互补原则人工合成一段与之互补的DNA片段，这一过程称为反转录。接着，在大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段的作用下，再以第一条DNA为模板，人工合成另一条互补的DNA子链。这种经过mRNA反转录人工合成的双链DNA被称为互补DNA（cDNA）。在细胞分化的不同阶段，根据代谢反应的特殊需要，特异性地转录产生编码特殊蛋白的mRNA。因此，用cDNA方法获取的DNA片段往往是具有特定功能的

4、目的基因聚合酶链式反应（PCR）PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。加入4种物质：（1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）聚合酶链式反应（PCR）变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链聚合酶链式反应（PCR

5、）每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得——230（1.07×109)个基因片段Molecularcellbiology4.0PCR技术的发明PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Mullis教授开汽车时的联想逶迤崎岖的山路行驶的汽车1988年发明了PCR技术1993年获诺贝尔奖