《重组DNA药物》PPT课件

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1、第七章重组DNA药物一、重组DNA技术与基因工程的基本定义重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。优点：1、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽；去除内源性

2、物质的不足之处2、提供足够数量的生理活性物质，以进行生理生化、结构的研究3、利用基因工程技术可发现、挖掘更多内源性生理活性物质4、获得新型化合物主要基因工程产品的研制、开发、上市时间产品人生长激素释放抑制素（SRM)人胰岛素首次克隆表达时间国家用途首次进入市场时间国家/地区1977日本治疗巨人症1978美国治疗糖尿病1982欧洲人生长激素（HGH)1979美国治疗侏儒症1985美国人α干扰素（α－IFN)1980美国治疗病毒感染症1985美国乙肝疫苗1983美国预防乙型肝炎1986欧洲人白细胞介素－21984日本治疗肿瘤1989欧洲人促红细胞生成素治疗贫血1988欧洲人粒细胞集落刺

3、激因子治疗中性白细胞减少症1991美国人组织纤溶酶原激活剂（t-PA)治疗血栓症1987美国DNA重组药物制造的主要步骤获得目的基因DNA的体外重组（切与连）载体的选择受体细胞的选择重组DNA分子转化（转）转化子的筛选与鉴定（选）外源基因的大规模表达和分离纯化产品的检验和制剂制备二、基本过程上游阶段：实验室获得目的基因、酶切和酶连、插入适当载体、转入宿主细胞、复制、目的基因分析确证、表达、筛选合适表达系统等下游阶段：将实验室成果产业化发酵参数确定、新型生物反应器研制、高效分离介质及装置开发、生物传感器设计制造、电子计算机优化控制、产品质量控制注意：上游DNA重组的设计必须以简化下游

4、操作工艺和装备为指导思想；而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现和保证，这是基因工程产业化的基本原则。1、目的基因的获得1）、鸟枪法（基因文库）基因组DNA提取→限制性内切酶部分水解→与载体连接→转化、扩增与筛选2）、逆转录法（cDNA文库）mRNA纯化→cDNA第一合成→第二链合成→cDNA克隆→将重组体导入宿主细胞→cDNA文库鉴定→目的cDNA克隆的分离和鉴定3）、合成法4）、PCR法4、PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）典型PCR反应包括①模板变性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（1～2′）③延伸72℃（1～2′）在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始

5、从5′→3′延伸。(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的扩增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5’3’3’5’引物1互补链引物2互补链目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)5’3’3’5’靶DNA片段引物A5’5’引物A’3’3’PCRPCRPCR3’3’5’5’PCR引物B引物C5’5’3’3’混合,变性,退火5’3’5’3’3’5’3’5’+DNA聚合酶5’3’3’5’5’3’3’5’用引物B和C作PCRPCR定点诱变PCR用于基因突变化学合成法在已知DNA序列或多

6、肽的一般结构时，如链长在60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。2、基因表达1）、选择宿主细胞原核大肠杆菌：生长快；遗传研究深入；产品多为胞内（包含体）或周质中；不能糖基化修饰。需注意内毒素污染。枯草芽孢杆菌：分泌力强，不形成包含体；不修饰；胞外酶可能会降解产物链霉菌：分泌能力强；不致病，安全；有糖基化能力。优点：易大量生产，成本低，周期短缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性真核酵母：研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物；基因组小，仅为大肠杆菌4倍；传代时间短；无毒；有分泌功能和修饰功能；已用于干扰素、乙肝表面抗原等重组

7、DNA药物的生产。丝状真菌：有很强的蛋白质分泌能力，能正确加工，糖基化方式与高等生物相似，有成熟发酵和后处理工艺哺乳动物细胞：类似天然产物，但培养条件苛刻大肠杆菌与真核细胞表达系统比较大肠杆菌:发酵包含体复性纯化目的蛋白真核细胞:发酵上清液纯化目的蛋白大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体高效表达的目的蛋白在大肠杆菌内形成大量无活性包含体。因无法有效的解决复性问题，在美国每年造成的经济损失就达几十亿美元包含体电镜图蛋白质复性概念将蛋白质从结构不规则、无活性的状态，恢复到有