《DNA重组的操作》PPT课件

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1、第六章DNA重组的操作一、粘性末端的连接（一）同一种酶产生的黏性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起单酶切、双酶切第一节DNA的体外重组DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的DNA称为重组DNA。两段DNA的连接DNA片断与载体的连接不足：目的基因的正反向插入载体或目的基因片段会自身环化载体与多个目的基因片段之间重组（二）不同种酶产生的黏性末端的连接（一）直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1~10%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’二、平末端

2、（bluntend）的连接将黏性末端变成平末端的方法：（1）5′突出黏性末端的补平采用大肠杆菌聚合酶Ⅰ的Klenow大片段（2）3′突出黏性末端的切平T4噬菌体DNA聚合酶或S1核酸酶在连接反应体系中加入：高浓度的DNA连接酶较高浓度的外源DNA和载体DNA低浓度的ATP低浓度的聚乙二醇平末端连接存在一些缺陷：（1）连接效率低；（2）破坏限制性内切酶原有的识别位点；（3）插入没有方向性；（4）高底物浓度下会产生多拷贝外源片段插入载体。（1）同聚物加尾法（二）人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核

3、苷酸。②加尾－碱基互补④缺点：③优点：能把任何片段连接起来操作繁琐；外源片段难以回收；同聚物尾巴影响外源基因表达。非酶切位点（2）衔接物（linker）连接Linker：用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：（1）多核苷酸激酶处理（2）T4连接酶连接（3）限制性内切酶消化（4）目的片段与载体连接（二）人工加尾形成“粘性末端”（3）接头分子（adapter）连接法①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

4、3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接②优点：连上后就能用。③缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。④防止自我连接5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-p5’Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-3’GGCC-p5’BamHIadapterP--P5’HO-GATCCCGG-GGCCCCGG-GGCCCTAG-OH5’5’HO-GATCCCGG3’GGCC-OH5’nick缺

5、口nick缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构5’端保护碱基＋内切酶识别序列3’端15～20bp与模板互补；避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5’--3’GCAGAATTC互补序列5’--3’3’模板GCAGAATTC互补序列PCR产物5’--3’3’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互补序列模板BamHI位点-5’3-’5’复性延伸模板模板3

6、’3’GCTAGCCGG互补序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGGPCR产物互补序列-5’3’-引物2带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--3’CCTAGGCGCPCR产物-5’3’-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoRI位点BamHI位点AATTCPCR产物5’--3’CCTAGPCR产物-5’3’-GGEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA三、PCR产物的连接2.与T载体直接连接四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。EcoR

7、IEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。2.DNA插入的方向正确用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意