《DNA重组的载体》PPT课件

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1、第二部分DNA重组的载体载体的三大功能：1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。2）为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合能力。3）为外源基因提供在受体细胞的的扩增和表达能力。理想载体具备四个条件：1）具有对受体细胞的可转移性，提高导入细胞的效率。2)具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，使外源基因在受体细胞中稳定遗传。具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，有利于外源基因的拼接插入。4)具有合适的选择标记（报告基因），便于DNA重组分子的检测。一．质粒载体(Plasmid)1．质粒的基本特性1）自主复制性。具有自己的复制起始位点(Origing)(ori)和控制

2、复制频率的控制基因及编码基因，形成独立复制子(Replico)结构。2）可扩增性。▲严紧型复制质粒(Stringent)由宿主细胞内聚合酶III介导，为质粒上编码的蛋白因子正调控，蛋白因子极不稳定，每个细胞复制1-5个质粒拷贝。▲松弛型复制质粒(Relaxed)质粒复制需要半衰期长的聚合酶I；聚合酶，以及辅助的蛋白因子参与，合成减弱或完全中断时，质粒复制持续进行，具有高拷贝数30-50个。▲当加入氯霉素抑制蛋白质生物合成，阻断宿主菌代谢途，而松弛型复制质粒利用丰富原料及能量大量复制，每个细胞积累上千个DNA分子。这个过程依赖质粒上基因产物与蛋白因子相互作用。3)可转移性在天然

3、条件下，野生型质粒通过细菌接合作用从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞。4）不相容性相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内，这种现象称质粒的不相容性。a)两种不同质粒同时进入受体细胞，两者复制的起始频率随机.b)分裂前夕的拷贝数不均等，经过若干次细胞分裂后必然导致，两种不同质粒的独占性。选择标记的插入失活插入失活2．质粒的改造与构建1）删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段装载量。2）灭活某些质粒的编码基因。3）加入易于识别的选择标记基因。4）选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列---多克隆接头.(Polylinker)

4、5）加入特殊的基因表达调控元件。载体的质粒构建过程图3-1，图3-2金属硫蛋白突变体基因α-α在蓝藻中克隆一．简介1．α-α小鼠金属硫蛋白突变体α结构域二聚体α-α，对重金属有强结合能力。2．PpSbA强启动子，在叶绿体，大肠杆菌，蓝藻中强启动功能3．pRL-αα中间载体，突变体与强启动子相连.4．PDC-αα穿梭表达载体，5．PCC7120鱼星藻目的：构建穿梭表达载体，含有强启动子，金属硫蛋白突变体基因，在蓝藻中表达。表明：转基因藻具有吸附金属的能力。穿梭表达载体的构建1．人工合成两引物，5’-GAGAATTCATTCATGTGCTGCTCCTGCTGCTGT-3’BamH

5、l5’-CTGGATCCTCAGGCACAGCAAGTGCAiGCA-3’E.coR1与PG2A进行PCR，得到突变体基因，两端含有E.coR1和BamH1双酶切位点。2.RL-439中间质粒。被E.CORI和BamHI双酶切.(1．2．)两者T4-连接酶连接，α-α基因定向克隆到强动子PpSbA之后.4.PpSbA强启动子，在叶绿体，大肠杆菌，蓝藻强启动功能5.穿梭表达载体的获得1)中间载体PRI-αα,穿梭表达载体pDC-08用EcoRI酶切2)T4-DNasa相连,3)用EcoRI酶切载体,鉴定。6.三亲结合转移与筛选，7.转化子鉴定。8.蛋白质印迹鉴定.图1愈伤组织小

6、块接种于不同比例的激素中，待分化。图2愈伤组织已长成。3．质粒的分类及用途1）克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。2）测序质粒：a)高拷贝复制，便于DNA片段克隆和扩增。b)含多酶切口的接头片段，在接头片段两端邻近区域，设有两个不同的引物序列，重组质粒变性后即可测序。3）整合质粒：含有整合酶编码基因和特异性整合位点序列，克隆在整合质粒上的外源基因进入受体细胞后，准确重组整合在染色体的特定位置上。4）穿梭质粒a)分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构及相应选择标记基因，因此能在两种不同种属的受体中复制并检测。大肠杆菌---链酶素穿梭质粒，大肠杆菌---酵母菌穿梭质粒。b)克隆在穿

7、梭质粒上的外源基因不用更换载体直接从一个受体菌转移至另一个受体菌中复制并遗传。5）探针质粒a)设计用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子，终止子。b)装有定量检测表达程度的报告基因，（抗生素的抗性基因）c)缺少启动子，终止子，载体本身不能表达报告基因d)当含有启动子，终止子的DNA片段插入合适的位点，报告基因才能表达。e)表达量的大小直接反应被克隆基因的表达调控元件的强弱。6）表达质粒a)在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转录效率较高的启动子，合适的核糖体结合位点（SD序列），终止子结构。使得克隆在