DNA重组的的基本操作

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1、第三章DNA重组的基本操作一、核酸的分离提取二、电泳技术三、外源DNA片段的制备四、转化方法五、重组克隆的挑选一、核酸的分离提取(isolate)（一）、DNA的提取一般原理：细胞分散：动物组织采用匀浆法；植物组织材料采用液氮法；微生物材料收集细胞，采用离心法。细胞破碎：对于动物材料，直接加入去污剂（多位SDS),有细胞壁结构的细胞，用分解细胞壁的酶处理，如溶菌酶处理大肠杆菌；用纤维素酶处理植物细胞等。然后用去污剂处理使细胞膜破裂，原生质体释放。去除蛋白：蛋白酶K处理；酚/氯仿抽提。去除RNA:RNase处理。核酸沉淀：乙醇沉淀；异丙醇沉淀。溶解：1XTE溶解定性分析：电泳分析，根

2、据标准分子量标准确定大小、纯度（有无RNA）定量分析：电泳，以标准含量的DNA确定浓度；紫外测定OD260。质量：OD280/OD260.DNA提取操作实例：质粒DNA的提取碱裂解法溶液1－GET缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，20mmol/L20mMTris-HClpH8.0，100g/mlRNasA4oC保存。溶液2－0.2mol/LNaOH,1%SDS溶液3－乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)：60mL的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2OTE缓冲液:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0,10

3、0%乙醇，70％乙醇1.质粒扩增1.1.从Amp抗性培养的培养平板上挑取生长状态好的单菌落，置于4ml的100ug/ml的Amp—LB液体培养基中，37℃，120rpm空气摇床培养4-5小时，待培养物约为对数生长期，用于扩大培养。1.2取500ml离心瓶，含有200ml的LB培养基（LB培养基配置见试剂配制），将过夜培养物，以备质粒提取。2.质粒提取2.1.取250ml离心瓶，将过夜培养物（200ml菌液）倒于离心瓶中，4000rpm，4℃，离心15分钟。2.2.上清液小心转入废液杯中，沉淀为菌体。将沉淀打散，加入4ml质粒提取液I，室温放置5分钟。2.3.将所有液体倒入50ml离

4、心管中（以下操作都在50ml离心管中进行），加入质粒提取液II8ml，混合后于室温放置5分钟。加质粒提取液III6ml，混匀，可见白色沉淀，冰上放置15分钟。2.4.10000rpm，4℃，离心15分钟，取液相。加入等体积的异丙醇混合，－20℃放置15分钟。2.5.10000rpm离心,4℃，15分钟,去上清，沉淀用5ml1×TE溶解后，加5ml5MLiCl混匀，10000rpm，4℃离心20分钟。2.6.取上清，加入等体积异丙醇沉淀，10000rpm离心15分钟。沉淀加入500μl1×TE溶液。将所得溶液吸入1.5ml离心管中。再加入3μlRNA酶，37℃放置2小时（以下操作均在

5、1.5ml离心管中进行）。2.7.加入等体积聚乙二醇溶液。12000rpm离心10分钟，收集沉淀。沉淀用400μl1×TE溶解。2.8.加入400μl饱和酚，混匀，12000rpm，离心3分钟，取上清至新的1.5ml离心管内。加入200μl饱和酚＋200μl氯仿，混匀，12000rpm，离心3分钟，取上清至新的1.5ml离心管内。加入400μl氯仿，混匀，12000rpm，离心3分钟。取水相至新的1.5ml离心管内。2.9.加入35ul3mol/L,然后加NaAC,700μl乙醇沉淀混匀，室温放置10分钟后，于4℃，12000rpm，离心5分钟，取沉淀。2.10.加入200μl80

6、%乙醇洗盐。置于37℃烘干。2.11.用100μl×TE溶解沉淀。3.检测3.1电泳检测3.1.1.配制0.8％的琼脂糖凝胶。称取琼脂糖0.24g,置于100ml的三角瓶中，加电泳缓冲液30ml,放于水平的桌子上，在三角瓶的水位线处作以标记。3.1.2.用牛皮纸包瓶口，于微波炉中加热至琼脂融化，取出，放于水平的桌子上，用蒸馏水补充到三角瓶的标记处。冷至60℃时，加溴化乙锭0.005%。3.1.3.在煮凝胶的同时，准备干净的可盛胶30ml的铸胶托盘一个，用透明胶带封两边的口。至于水平桌面上，放上1mm厚，5mm宽的梳子。3.1.4.将凝胶倒入托盘中，自然冷却。3.1.5.上样1ul，

7、15cm/100V电泳1小时。3.1.6.观察RNA和核DNA是否除净。（RNA片段较小，跑在最前面；核DNA片段很大，位于胶孔跑不出来）。如果核DNA的亮度强于质粒条带，质粒提取不合格，重新抽提。3.2．OD值的测定2.2.1.取石英比色杯一支，加3ml蒸馏水，加入DNA溶液10ul用紫外分光光度计测OD260和O.D280。2.2.2计算公式:DNA含量（ug/ul）=50XO.D260X3/10培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到液体培养基，37℃培养12～16