铁皮石斛愈伤组织言秀导培养中污染问题.doc

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1、学院：生命科学与技术学院专业：农学学号：2姓名：曾通明指导老师：薛春丽铁皮石斛愈伤组织诱导培养中的污染问题曾通明（红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自661100）摘要以铁皮石斛无菌苗的茎段作为外植体，讨论MS培养基中添加不同浓度的激素对铁皮石斛的诱导、增殖、分化以及生根的影响。结果表明：最适合铁皮石斛茎段根诱导的培养基为MS+IBA1.5mg/L+香蕉汁100g/L。同时以铁皮石斛愈伤组织培养快速繁殖过程中出现了各种污染，并以此为对象,分析污染发生的原因,研究对此应采取的控制措施。结果表明:外植体的消毒灭菌程度和

2、接种过程中是否存在有菌环境等是引起污染的主要因素，而细菌和真菌是引起污染的次要因素;污染在组织培养的每一步骤都会发生;注重无菌操作的训练,提高操作水平是降低污染率的重要手段。关键词：铁皮石斛；诱导；组织培养；污染前言铁皮石斛（Dendrobiumofficinale）是兰科石斛属植物，又名铁皮枫斗、黑节草，主要分布于云南、安徽、贵州、浙江、江西、广东、广西等地，不仅是名贵的室内盆栽花卉，还是一种珍贵的中药材，在《神农百草经》中记载，铁皮石斛具有滋阴清热，生津益胃，润肺止咳，润喉明目，延年益寿的功效，是日常生活的保健

3、佳品。天然状态下主要生长于悬崖峭壁上，自然繁殖力低，加上药农掠夺性挖采，造成自然资源匮乏、濒临绝迹的境况。而常规条件下人工繁殖又较难，长期以来组织培养在植物生产中得到广泛应用，是产生极大经济效益的一项生物技术[1]。1试验材料与方法原理1.1试验材料和用具材料：多年生铁皮石斛植株茎段。实验药品：1/2MS基本培养基、琼脂、NAA、6-BA、70%酒精、0.1%Hgcl、无菌水等。实验用具：超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、PH试纸、分析天平、酒精灯、剪刀、镊子、试管、培养瓶、烧杯、移液管、量筒、脱脂棉、火柴、手术刀等。1

4、.2实验原理已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞，这个过程称为脱分化（dedifferentiation）。来自于植物各种器宫的外植体在离体培养条件下，细胞经脱分化等一系列过程，改变了它们原有的特性而转变形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，即愈伤组织。一般情况下，植物各器官和组织均有诱导产生愈伤组织的潜在可能性。植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素。生长素是用于诱导愈伤组织形成的生长物质，常用的种类有

5、2,4-D,IAA和NAA,所需浓度在0.01～10mg/L范围内；常用的细胞分裂素是激动素、玉米素和6-BA，使用的浓度范围在0.1～10mg/L。对有些植物材料而言，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成。来自于不同植物、同一植物的不同器官或组织，产生的愈伤组织在质地和物理性状方面是有差别的。在一定条件下，离体的外植体可以形成愈伤组织（即一块未分化的组织），形成愈伤组织的过程也是细胞的脱分化过程。已有的实验表明，所有的多细胞植物，包括双子叶植物和单

6、子叶植物，都有诱发愈伤组织形成的潜在可能性。一般认为诱发愈伤组织成败的关键不在于植物材料的来源，而在于培养的条件。外植体上损伤的细胞能释放一种自溶产物，对诱导细胞的分裂起着重要的作用。一般要经过愈伤组织的细胞脱分化、人工诱导再分化两个不同的阶段，因此在这些实验中愈伤组织的诱导是否成功也是关键的基本因素。总之，愈伤组织诱导条件的选择在植物细胞培养技术中占据着非常重要的地位。1.3试验方法1.3.1无菌系建立从1多年生铁皮石斛植株上选择生长健壮的茎段，摘去叶片和膜质叶鞘，剪成约2cm长带节的小段，用洗衣粉清洗后置流水下

7、冲洗20min。在超净工作台上用75%的酒精消毒30s，0.1%HgCl2灭菌5min后，用无菌水冲洗5~6次，放入垫有干无菌滤纸的培养皿中，以吸去多余水分，茎段两端各切去0.2~0.3cm，插入备好的垫有干且无菌的培养皿中，等待接种。1.3.2培养基配制配方：A.愈伤组织诱导的培养基配方是1/2MS+1.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+外源添加物。B.外源添加物：香蕉、马铃薯、番茄I、以MS为基本培养基，根据正交试验设计的配方进行配制：配制母液Ⅱ、取少量的蒸馏水（约为配

8、制培养基量的2/3）加入烧杯中。Ⅲ、加琼脂7.5g/L，边加热边搅伴。Ⅳ、加入蔗糖30g/L，边加热边搅伴。Ⅴ、按母液顺序和规定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入烧杯中。Ⅵ、通过计算，用微量移液器取所需的各种生长调节剂母液。Ⅶ、定容：当琼脂、蔗糖溶解，试凝成功后，用蒸馏水水定容至所配制的数值。Ⅷ、调pH值：用1mol/LNaOH和1mol/LHc