铁皮石斛的组织培养

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1、由于石斛自然繁殖力极弱，生长缓慢，加之人们掠夺性采挖，资源已严重枯竭。而石斛栽培一直未解决其存活率低、进入盛产期年限长等问题，故石斛药源一直处于紧张状态。因此，组织培养、遗传转化、菌根技术、悬浮培养等生物技术在石斛的应用意义重大，甚为迫切。石斛的组织培养，可用种子、根、茎尖、茎节及叶等为外植体，但以种子进行组培快繁的为多。原球茎的增殖分化是石斛试管苗繁殖的关键，因此，研究原球茎增殖分化的适宜培养条件非常重要。特别是应用组织培养技术快速大量繁殖石斛试管苗，是解决其种苗与发展生产的有效途径。铁皮石斛的组织培养铁皮石斛，又名铁皮兰、节草、耳环石斛

2、等。野生铁皮石斛为国家珍稀濒危保护植物（三级）。由于其生长环境要求特殊，野生资源已濒临灭绝。现云南晨安生物科技开发有限公司对铁皮石斛的组培快繁已获成功，月出苗量50万瓶以上，为铁皮石斛工厂化育苗和大面积栽培闯出了一条新路。1胚培养（种子培养）：取人工授粉的铁皮石斛果实，用75％的乙醇表面消毒，30s后再用0.1％升汞溶液消毒8min，无菌水冲洗4~5次。在无菌操作下，把果实切成0.1mm见方的小块，接种到培养基上，每瓶3~5块。研究结果表明，N6培养基对种子萌发和生长最好，蔗糖浓度2％最佳，NAA浓度0.2~0.5mg/L最适合胚的萌发和生

3、长；种子培养中加入椰乳对胚萌发和萌发后的初期生长起促进作用；而香蕉汁对继代培养中石斛的生根和壮苗起促进作用，生根和壮苗培养中不加入NAA，只用N6+10％香蕉汁，苗长得更粗壮。培养温度25~28℃，光照强度1600~2000lx，每日10~12h。种子萌发后，转管3~4次，当幼苗长出4~5片真叶并具有3~4条1~2cm长的根时，可将试管苗进行炼苗后移栽。在实验中尚发现，石斛原球茎的增殖与胚龄相关，不同胚龄培养，其萌发率不同：胚龄45天以下，萌发率极低，萌发时间长；60天胚龄的胚具34个细胞，萌发率为6％；90天胚龄的胚细胞为74个，萌发率为

4、87％；120天胚龄的细胞数为90个，萌发率95％以上。实验表明，组织培养的最适胚龄以种子成熟时较好，随着胚龄增长，其胚细胞愈多，萌发率越高。原球茎增殖分化的最适培养基为改良N6+NAA0.2mg/L+2％蔗糖。种子萌发成苗后需及时将小苗转移到合适的培养基中进行生根、壮苗培养。有报道，铁皮石斛试管茁壮苗阶段的适宜培养基为B6（或1/2MS）+10％香蕉水提物+NAA2.0mg/L+2％蔗糖。生根壮苗培养基为改良N6+10％香蕉+2％蔗糖，苗长得更粗壮。将萌芽石斛继代培养于N6+10％香蕉汁生根壮苗培养基中，苗长得更粗壮。2茎尖培养：取铁皮石

5、斛当年萌发的嫩茎尖，用10％次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗4~5次后接种到培养基上。研究结果表明，培养温度为25~28℃，光照度1600~2000lx，每日光照10~12h。在MS+NAA0.2mg/L+6-BA0.5mg/L培养基中培养30天左右，外植体则可诱导出大小不一的白色颗粒状愈伤组织，再过20天形成不定芽。将愈伤组织和不定芽切割开，再接种到MS+NAA0.2mg／L+6-BA0.5mg/L中，愈伤组织会增殖并产生不定芽，再将不定芽移到N6+10％香蕉汁中培养30天左右，则会生根长成植株。3幼嫩茎段培养：剪取铁皮石斛幼嫩茎段，按

6、常规表面灭菌，切成2.0cm左右的切段，每一切段应至少保留1个节，将其接入芽增殖培养基MS+NAA0.1~0.5mg/L+6-BA0.5~2.0mg/L。（蔗糖浓度3.0％，PH5.4~5.8，下各培养基均同）中培养。培养条件：培养温度（25±2）℃，连续光照培养，光照强度1500lx。培养30~50天后，可在节间处长出1~2个新芽。将新芽切下，再接入芽增殖培养基中继代培养，经过30天培养，在切口处长出4~6个芽，形成丛生芽簇。将丛生芽切割后，在芽增殖培养基中继续增殖培养，则可获得大量丛生芽。将上述丛生芽切割成单苗，转入壮苗培养基MS（无激

7、素）中培养，40天后，芽可发育成高3.0cm以上并具2~3片叶的健壮无根苗。再将经过壮苗培养的无根苗，转接到生根培养基1/2MS+IBA0.1mg/L中培养40~60天，在苗基部便可长出多条肉质、绿色气生根，形成完整植株。尚有报道，取铁皮石斛茎，去叶、洗净、表面灭菌后，在无菌条件下切成约5mm长的小段，每段必具一个茎节，接种于1/2MS或努森培养基内，置（26±1）℃光照条件下培养，约2周，腋芽长出，约1个月则可形成完整植株。4炼苗与移栽：当试管苗有4~5片叶展开，并具有3~4条1~2cm长的根时，即可揭开瓶盖，在室内炼苗1周后，将再生植株

8、移植于细土与牛粪（1：2）的栽培基质中，盖上薄膜，保持湿度90％以上，基质以湿润、不积水为宜，置通风阴凉处，成活率可达60％。或以碎砖4份，碎木炭1份，珍珠岩和蕨根适量组合为移栽