多克隆抗体的制备.ppt

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1、张江中试平台多克隆抗体的制备及抗体活性测定主要内容多克隆抗体制备的基本原理多克隆抗体制备的操作步骤抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断原理1、克隆(clone)：是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中，如无发生突变其基因是完全相同的。2、多克隆抗体（polyclonalantibody,pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。3、单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAb）：由

2、一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonalantibody）；第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)；第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(geneticengineeringantibody)。抗体发展历史多克隆抗体制备流程免疫原的制备免疫动物免疫血清的收集免疫血清的鉴定免疫血清的保存免疫原（immunogen）：指能

3、刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）.免疫原种类：天然抗原、人工合成抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原。免疫原的制备细胞性抗原制备：绵羊红细胞（SRBC）-溶血素；细菌-抗菌抗体（动物免疫血清）。可溶性抗原制备：指蛋白质、多糖和脂类等。细胞破碎反复冻融法超声破碎法自溶法酶处理法表面活性剂处理法超速离心分离：是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。选择性沉淀：选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境，如：核酸去除盐析沉淀法有

4、机溶剂沉淀法高分子聚合物沉淀法50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；8%～12%PEG6000可沉淀IgG。粗分离超滤法：利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛。电泳精分离层析法：凝胶过滤层析离子交换层析亲和层析疏水层析反相层析鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。蛋白含量—凯氏定氮（紫外光280nm等），Lowry分子质量—电泳、质谱蛋白纯度—电泳、HPLC免疫原性—免疫印迹、免疫双扩散、免疫组化蛋白活性—ELISA、XTT蛋白结构—红外光谱、氨基酸测序蛋白等电点—IEF蛋白鉴定免疫佐剂某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，

5、可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。佐剂的种类佐剂一般包括以下几类：无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等；生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（polyI：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（polyA：U）；油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；纳米佐剂弗氏佐剂（Freund’sadjuvant）分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种：前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐

6、温-80）按1：1～1：5比例混合而成；后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水”乳化液。佐剂与抗原混合乳化的方法：研磨法搅拌混合法佐剂的免疫生物学作用增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原；增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度；改变抗体类型，使产生抗体由IgM型转变为IgG型；引起或增强迟发性超敏反应。佐剂的作用机制佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，

7、形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。动物免疫免疫动物的选择：抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。动物个体的选择：适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。免疫方法选定动物后，在免疫过程中应考虑