[整理]多克隆抗体的制备(1)(1)教学讲义ppt.ppt

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1、多克隆抗体的制备(1)(1)二、实验原理抗体：介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原激活后增殖分化为浆细胞所合成分泌的一类能与相应抗原特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。单克隆抗体：抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇激活具有相应抗原受体的B细胞产生的针对这一抗原决定簇的抗体，称为···天然抗原分子中常含有多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生的抗体中含有针对多种不同抗原表位的免疫球蛋白，称为多克隆抗体。多克隆抗体动物的选择动物的选择常根据抗体的用

2、途和量来决定，也与抗原的性质有关如要获得大剂量的抗体，则采用大动物；如要获得直接标记诊断用的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体动物的选择如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，免疫时应同时选用数只动物进行免疫一般实验室采用的抗体，多用兔子和羊；抗原就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等.根据物理性状可分为颗粒型抗原和可溶性抗原。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。为了获得较好的抗血清，最好

3、是选用蛋白质抗原不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等本次实验采用抗原是生科大实验制备的LDL（至少有2mg，如量不够则用牛血清白蛋白），用生理盐水溶解。抗原剂量的选择抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类，免疫次数，注射途径，以及受体动物的种类，免疫周期及所要求的抗体特性等而不同。剂量过低，不能形成足够强的免疫刺激剂量过高，有可能造成耐受在一定范围内，抗体效价随注射抗原的剂量而增高。抗原剂量的选择小鼠首次抗原剂量为：50-400μg/次大鼠为

4、100-1000μg/次兔子为200-1000μg/次加强免疫的剂量为首次剂量的1/5-2/5佐剂概念：预先与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质。种类：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。目前应用最多的是弗氏佐剂。佐剂佐剂的条件作为一种良好的佐剂，必须具备下列条件：（1）增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；（2）佐剂与抗原混

5、合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；（3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能；（4）良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。佐剂主要作用机制：①改变抗原物理性状，延缓抗原的降解和排除，延长抗原在体内滞留的时间②刺激单核-巨噬细胞系统，增强其对抗原的处理和提呈能力③刺激淋巴细胞的增殖分化，从而增强和扩大免疫应答的能力佐剂主要用途：①增强特异性免疫应答，用于预防接种及制备动物免疫血清②作为非

6、特异性免疫增强剂，用于抗肿瘤与抗感染的辅助治疗弗氏佐剂动物实验中最常用的佐剂：①弗氏不完全佐剂(incompleteFreund'sadjuvantIFA)羊毛脂1份+石蜡油5份，混合，高压灭菌后保存。用时加热融化，冷却至50℃左右，加抗原进行乳化处理。②弗氏完全佐剂(completeFreund'sadjuvant,CFA)弗氏不完全佐剂10ml+卡介苗10mg～200mg卡介苗可100℃10min灭活处理。四、步骤和方法颗粒性抗原多克隆抗体的制备——伤害杆菌O抗血清的制备（介绍）1、伤害杆菌O抗原的制备：接种37℃

7、18-24h洗下菌苔（用NS）100℃1h过滤4000r/min,20min得到原液稀释109/ml应用液颗粒性抗原多克隆抗体的制备——伤害杆菌O抗血清的制备（介绍）2、免疫方法：选择体重2-3kg的健康家兔，将已经稀释好的抗原按下列剂量及程序做皮内注射。第一天注射1ml，第8天注射1ml，第15天注射2ml，末次注射后7天颈动脉放血，测效价。可溶性抗原多克隆抗体的制备第一次免疫（基础免疫）第一次加强免疫第二次加强免疫效价测定2-4周2-3周7天第一次免疫（基础免疫）免疫乳剂的制备①研磨法:取1.2ml佐剂加入到无菌的

8、研钵中，缓慢加入1ml抗原+0.2ml卡介苗混合液，每加一滴研磨至小滴消失，边加边往同一个方向研磨，抗原全部加入后继续研磨至乳白色粘稠的油包水乳剂。①研磨法本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。注意事项：⑴每加一滴应研磨至小滴消失，滴加速度要慢⑵边加边往同一方向研磨，否则不易制成乳白色粘稠的油包水乳