大豆内生细菌种群多样性PCR—DGGE分析方法的优化研究-论文.pdf

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1、第30卷第3期黑龙江大学自然科学学报VoL30No．32013年6月JOURNALOFNATURALSCIENCEOFHEILONGJ『IANGUNIVERSITYJune，2013大豆内生细菌种群多样性PCR—DGGE分析方法的优化研究孟利强，赵晓宇，张先成，李晶，张淑梅，曹旭，沙长(1．黑龙江省科学院微生物研究所黑龙江省生物工程重点实验室，哈尔滨150010；2．黑龙江省科学院条件财务处，哈尔滨150001)摘要：建立了一种适合研究大豆内生细菌种群结构的PCR—DGGE分析方法，筛选适合分析大豆内生细菌的引物，采用巢氏PCR方法获得内生细

2、菌16SrDNA的V6、V7、V8三个高变区，通过优化DGGE技术的变性梯度范围、电泳时间和上样量的大小来获得最佳的DGGE条带图谱。经过优化确定了适合大豆内生细菌研究的引物为968F一1378R，变性剂梯度为40％～60％，且在电压180V时电泳时间6h最为合适，上样量为15L时可获得高分别率的DGGE条带。关键词：大豆；内生细菌；基因组；多样性；PCR—DGGE中图分类号：Q93．31文献标志码：A文章编号：1001—7011(2013)03—0390—060引言内生细菌是植物微生态系统中的天然组成部分，研究发现健康植物体内存在细菌，并且

3、他们能够起到促进宿主的生长或增强宿主植物的抗性等作用I2J。近年来，随着不同种类植物内生细菌的不断发掘，有关内生细菌的研究越来越引起人们的关注。植物内生细菌可以作为生防因子应用到植物病虫害的防治方面，这样不仅可以防治植物病害还可以减少化学农药的使用，从而可以降低其对环境的污染J。目前，对于植物内生细菌的研究一般都采用传统的培养方法，但由于人们对内生细菌的生长条件尚不清楚，所以人为可分离和培养的内生细菌只是其中的一小部分，这就导致该方法不足以全面地分析植物内生细菌种群的多样性信息_4J。随着微生物生态学研究的不断进步，多种非培养方法被应用于植物

4、内生细菌的研究中，如限制性片段长度多态性(RFLP)、末端限制性片段长度多态性(T—RFLP)、扩增rD—NA限制性分析(ARDRA)、构建16SrDNA克隆文库和变性梯度凝胶电泳(DGGE)等J。DCGE(Denatu—ringGradientGelEleetmphoresis)是1983年Fischer等首先提出的一种用于检验点突变的电泳技术，并于1993年首次被应用于微生物群落结构的研究。利用DGGE技术对细菌16SrDNA序列进行分析，不仅可以研究内生细菌群落的组成和动态变化，还有助于研究样品中不可培养细菌的种类-8]。2008年，郑

5、斯平等应用16SrDNAPCR—DGGE技术揭示了满江红内生细菌的遗传多样性，确定了一个以蜡质芽孢杆菌为优势种群的复杂细菌区系。然而，到目前为止国内外还没有利用DGGE技术研究大豆内生细菌的相关报道。基于PCR—DGGE技术自身的特点，本文对大豆内生细菌种群多样性PCR—DGGE分析方法的优化进行了研究，为了避免样品种类繁多以及其他干扰因素的影响，确定了典型样品的相关重要试剂的用法、用量以及一些实验细节，以期为后续研究提供技术指导。收稿日期：2013一Ol一23基金项目：哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目(2012RFXYN025)；黑龙江

6、省科学院青年创新基金项目(2011HK009)。作者简介：孟利强(1983一)，男，助理研究员，硕士，主要研究方向：农业微生物，分子生物学，E-mail：mengliqiang8342O@163·tom通讯作者：沙长青(1965一)，男，研究员，硕士研究生导师，主要研究方向：生物技术，微生物学，Email：shachangqing@vip·163·com引文格式：孟利强，赵晓宇，张先成，等．大豆内生细菌种群多样性PCR—DGGE分析方法的优化研究【J]·黑龙江大学自然科学学报2013．30(3)：390—395．第3期孟利强等：大豆内生细菌种

7、群多样性PCR—DGGE分析方法的优化研究·391．1实验方法1．1仪器与试剂通用突变检测系统(美国伯乐公司)；BIO—RAD电泳仪(美国伯乐公司)；PCR仪(Ependorf公司)。次氯酸钠、无水乙醇、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖、硝酸银、甲醛、冰醋酸、氯化钠、氢氧化钠、离子甲酰胺、尿素、乙二胺四乙酸(EDTA)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，三羟甲基氨基甲烷(s)，聚乙烯毗咯烷酮(PVP40)均为分析纯；水为超纯水。大豆植株(黑农58)采自哈尔滨市香坊区黎明乡双榆树村，样本为大豆根、茎和叶其中的一个组织，均采集于大豆的四叶期。1．

8、2实验方法1．2．1大豆基因组DNA的提取及纯化按照参考文献[10]的方法提取样本总DNA，并对其进行0．8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收总DNA条带，采用胶回收试剂盒