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1、·564·人民军医2003年第46卷第10期(总第527期)军人肺结核分枝杆菌耐药性与耐药基因检测研究王 巍 李洪敏 王安生 吴雪琼 王仲元100091 北京 解放军309医院 刘金伟 林明贵 陈红兵 王金河 李素梅【摘要】 目的:了解军人肺结核病人结核分枝杆菌耐药情况及评价耐药基因检测的应用价值。方法;采用聚合酶链反应2单链构象多态性分析(PCR2SSCP)检测结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变,用绝对浓度法作药物敏感试验,采用耐药基因检测等方法,对我院1995年1月～2002年6
2、月痰结核杆菌培养阳性的肺结核菌种进行鉴定、检测其耐药性,并与地方肺结核病人进行比较。结果;军人组和非军人组初治耐药率分别为3115%和4018%复治耐药率分别为7815%和7612%。复治耐药率均明显高于初治耐药率(P<0105)。军人组耐药频度从高到低依次为异烟肼、利福平、链霉素、吡嗪酰胺和乙胺丁醇,非军人组为利福平、异烟肼、链霉素、吡嗪酰胺和乙胺丁醇。用药>6个月者耐药率为6910%,显著高于其他各组(P<0101)。药敏试验阳性株的耐药基因检测阳性率为3319%～8519%,耐药基因检测阳性株的药敏试验阳性率为
3、9210%～100%。结论:军人结核病人耐药情况与地方病人相类似,应重视军人肺结核病人耐药性监测,耐药基因检测有潜在的应用价值。关键词:结核分枝杆菌;肺结核;药物耐受性;耐药基因 中国图书分类号:R82512 目前,我国结核分枝杆菌耐药病人增加,但报道mg/L,利福平(RFP)250mg/L,链霉素(SM)100军人肺结核病人结核分枝杆菌耐药性和耐药基因检mg/L,乙胺丁醇(EB)50mg/L,吡嗪酰胺(PZA)250测的文献较少。为此,我们对近7年军人肺结核病mg/L。聚合酶链反应2单链构象多态性分析(PCR
4、2人有培养结果的71株结核分枝杆菌耐药性结果与SSCP):利用我院自行研制的rDNAPCR扩增试非军人进行了对比分析,部分耐药株在常规药敏试剂,在25μl反应体系中,4XdNTP的终浓度各为验和耐药基因检测相互间进行了比较,结果发现以012μmol/L,引物Ⅰ、Ⅱ的终浓度各为013μmol/L,上均有差异。纯化的DNA模板5～25ng,TaqDNA聚合酶1U。至DNA热循环仪,按94’C变性50s,58℃退火11 对象和方法min,72℃延伸1min,扩增35个循环,最后在72℃111 对象 军人组71例中,年龄26
5、15±1412岁。延伸7min。取3μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶中初治57例,复治14例。病程1个月～22年,平均电泳检测扩增产物。耐药基因完全缺失,PCR扩增211个月。非军人组均为同期住院的地方肺结核为阴性。将临床分离株与结核分枝杆菌标准株的130例,年龄2719±1613岁,初治71例,复治59DNA2PCR扩增产物加在同一块8%(29÷1)非变性例,病程2个月～25年,平均314个月。耐药性分聚丙烯酰胺凝胶中,4℃100～120V电泳6h,银染类:将同时耐利福平和异烟肼或耐这两种药物以上色后观察结果并照相。者
6、的结核杆菌视为耐多药结核菌。113 结果判定 PCR产物与RFP、INH、SM、112 方法 耐药性测定方法和耐药标准判断按照PZA和EB标准株DNA扩增产物对照,若呈现泳[1]《全国结核病诊断细菌学检验规程》进行,标准株动异常,则判定存在基因突变。2由卫生部生物制品鉴定所提供。部分结核分枝杆菌114 统计学处理 组间比较采用χ检验。rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因检测试剂由本2 结 果院结核病分子生物学实验室提供,引物系统见文献[2]。痰标本前处理后,经Bactec2960仪培养3～7211 两
7、组耐药情况比较 军人组初治57例,耐药天,一部分培养物做药敏试验,一部分培养物提取18例(3115%),复治14例,耐药11例(占复治的DNA,至-20℃备用。同时进行7H10培养基药7815%)。非军人组初治71例,耐药29例敏试验。培养基内含药浓度如下:异烟肼(INH)10(4018%);复治59例,耐药45例(占复治的人民军医2003年第46卷第10期(总第527期)·565·7612%)。军人组初治耐药率和复治耐药率与非军相比,有显著差异(P<0105)。耐药29例中,不规人组分别相比,无显著差异(P>010
8、5)。但两组复范治疗23例,(包括化疗方案不规范、不规律服药、治耐药率均显著高于初治(P<0101)。无故停药、改药和单一加药及因严重药物不良反应212 耐药种类和频度比较 军人组除利福平的耐而停药等)。其中年龄>55岁21例。药率显著低于非军人组外,其余4种药物无显著差215 耐药基因检测与常规药敏结果比较 部分结异(表1)。核分枝杆菌常规药
