基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性临床价值

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1、基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性临床价值　　[摘要]目的探讨基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的临床价值。方法回顾性分析685例结核病临床疑似病例的临床资料，采用晶芯结核分枝杆菌生物芯片技术进行检测。结果本组685例临床疑似病例中，阳性135例，阳性率为19.7%，基因芯片检测结果显示结核131例，非结核4例，阳性率为19.1%。耐药基因检测68例，利福平和异烟肼基因突变12例，总突变率为17.6%，其中11例为利福平和异烟肼均耐药，双重基因突变率为16.2%，另1例只耐利福平。利福平总突变率为17.6%，异烟肼总突变率为1

2、6.2%，耐多药率为16.2%。结论晶芯结核分枝杆菌生物芯片技术用于临床诊断结核病及其耐药性，能够缩短诊断时间，提高临床时效性，值得推广应用。[关键词]结核分枝杆菌；基因芯片；结核病诊断[中图分类号]R378.91+1[文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2014）01（b）-0123-037国内每年有将近13万人因结核病死亡[1]，且有将近12万新发耐多药结核病患者，未来数年内可能出现耐药菌为主的流行态势[2]。目前，结核病诊断的标准方法主要包括分枝杆菌分离培养、抗酸菌痰涂片镜检、菌种鉴定和药敏试验等，但是其普遍存

3、在特异性差、灵敏度低或需时长的缺点[3]，本院引进国内最新的结核诊断技术——晶芯结核分枝杆菌生物芯片诊断系统，是近年发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法[4]，其应用于临床诊断结核病，提高了时效性，现报道如下。1资料与方法1.1一般资料本院2013年3月1日～2013年9月30日接受诊治的结核病临床疑似病例共685例，其中男性363例，女性322例；年龄9～76岁，平均（34.51±2.28）岁；其中临床诊断结核病病例681例，包括185例痰结核菌培养阴性肺结核，157例痰结核菌培养阳性肺结核，193例结核性脑膜炎，95

4、例结核性胸膜炎，51例骨结核。非结核分枝杆菌病4例。1.2试剂与仪器Extractor36核酸提取仪、BioMixerⅡ芯片杂交仪、SliderWasher芯片洗干仪、LuxScan10K-B芯片扫描仪、晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂盒、晶芯结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，均购自博奥生物有限公司。1.3方法1.3.1标本的处理以痰样本为例（其余样本同痰样本处理方法）：①向痰液中加入等体积10%NaOH，涡旋振荡，充分液化均匀，也可37℃液化30min后再振荡；②取17ml液化后的痰液转入1.5mlEppendorf管中，12000r

5、/min，5min，弃去上清；③加入1ml生理盐水，涡旋振荡后12000r/min，5min，弃去上清。1.3.2核酸提取①向处理好的标本管内加入80μl核酸提取液，用加样器混匀后转入核酸提取管内；②用核酸快速提取仪振荡10min，然后95℃水浴5min。1.3.3PCR扩增①从B试剂盒取出PCR扩增试剂，自然解冻后轻摇，迅速离心后分装18μl至八联排管中，加上盖，标上编号；②加入2μl样本核酸溶液，用加样器吸打混匀；③上机扩增。1.3.4芯片杂交①将PCR产物置PCR仪扩增95℃变性5min，随后立即放入冰水混合物中，骤冷冰

6、浴3min；②取9μl杂交缓冲液至八联排管中，再按样品顺序加6μlPCR产物；③准备杂交盒，将14μl杂交混合物加入芯片点阵中，完成后且金属封条密封杂交盒；④放入杂交仪内50℃杂交2h；⑤将芯片洗干，甩水。1.3.5芯片扫描结果判读开启扫描仪，预热激光10min，输入芯片编号，样本信息，选择样本，开始扫描，并判读结果。2结果2.1结核分枝杆菌基因芯片检测对结核病的诊断结果7本组结核菌基因检测685例临床疑似病例中，阳性患者135例，阳性率为19.7%，通过基因芯片检测结果显示，结核患者131例，非结核患者4例，阳性率为19.1

7、%。2.2结核分枝杆菌基因芯片法耐药基因变异的检测结果随机选取68例阳性患者进行耐药基因检测，通过基因芯片检测结果显示，12例患者发生基因突变，总突变率为17.6%；其中11例患者为利福平和异烟肼双重基因突变，双重基因突变率为16.2%，另1例只发生利福平基因突变；耐多药率为16.2%。利福平总突变率为17.6%，其中9例为531（C-T）位点突变，3例为526（C-T）位点突变；异烟肼总突变率为16.2%，其中7例患者为katG315（G-C）位点突变，3例为inhA-15（C-T）位点突变，1例为katG315（G-A）位

8、点突变。3讨论7结核病严重危害人民群众的身心健康，已经成为全球共同关注的重大社会问题和公共卫生问题[5]。目前，结核病诊断的主要方法包括分枝杆菌分离培养、抗酸菌痰涂片镜检、菌种鉴定和药敏试验等，存在极易漏检、敏感性低或时效性差的问题，培养法需要4周左右才能获得结果，而药敏试验