甲状腺癌功能性miRNA地鉴定、临床意义及其作用机制.doc

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1、甲状腺癌功能性miRNA的鉴定、临床意义及其作用机制开题报告人:王培松指导教师:陈光教授报告内容n1.背景及选题依据n2.研究目的及意义n3.研究内容及关键问题n4.研究方法n5.研究条件n6.研究进度及具体安排n7.本题创新之处n8.预期结果背景及选题依据n甲状腺癌发病占甲状腺结节的5-20%、全身肿瘤的1.5%，是内分泌系统最常见的恶性肿瘤。近年许多资料显示甲状腺癌的发病率逐年上升,是近年备受关注的肿瘤之一,也是内分泌系统肿瘤领域的研究热点。2008年估计美国新发病例37340,1590人死于甲状腺癌。由于甲状腺癌多起病隐匿,常以无痛性甲状腺结节为最初临床表

2、现,因此早期诊断较为困难。目前常用诊断方法包括触诊、超声、核素显像、细针穿刺细胞学活检等,其中细针穿刺细胞学活检是筛查和早期诊断甲状腺癌的有效方法,但仍然存在一定的假阴性率和部分无法确诊的病例,且需考虑患者的依从性。因此，研究鉴定早期诊断预警分子，是目前甲状腺癌临床研究所面临的瓶颈问题，有重要临床意义。越来越多的实验数据逐步建立了肿瘤与miRNA表达变化的关联，提示我们在不同的肿瘤中检测特定的miRNA的表达变化很可能成为肿瘤诊断、分期和预后预测的有力工具。但甲状腺癌中的miRNA尚知之甚少。研究目的及意义n通过检测甲状腺良恶性肿瘤及其配对血清中miRNA的差异

3、表达情况，分析与患者临床病理特征及其生存情况的相关性，鉴定出与甲状腺癌发生发展，特别是早期癌变密切相关的功能性miRNA。为通过检测新型miRNA开展甲状腺癌早期诊断及预后分级提供新途径。研究内容及关键问题n1、研究候选miRNA在甲状腺癌中的表达特征与甲状腺癌发生发展的相关性。采用定量RT-PCR检测3-5个候选miRNA在30例甲状腺癌组织及癌旁正常甲状腺组织样本及30例良性甲状腺疾病组织中的表达；分析这些miRNA与甲状腺癌患者临床病理特征及其生存情况的相关性；在此基础上，从中筛选出1-3个具有重要临床意义的miRNA。n2、检测不同临床分期，特别是早期甲

4、状腺癌患者血清中的上述miRNA的表达变化规律，分析将这些miRNA作为甲状腺癌早期诊断预警分子的精准性。n3、通过检测同一患者多发灶同一miRNA的表达，探讨其多灶性起源的原因。n4、研究揭示具有重要临床意义的miRNA在甲状腺癌发生发展，特别是在早期癌变中的功能及其作用机制，为通过检测新型miRNA开展甲状腺癌早期诊断及预后分析提供新途径。通过BrdU和克隆形成等实验确定miRNA是否与甲状腺癌细胞的分裂增殖密切相关；通过细胞移动和细胞侵袭等实验确定候选miRNA是否在甲状腺癌细胞的侵袭和转移中发挥作用；最后通过定量RT-PCR和免疫印迹（westernbl

5、ot）等技术手段，确定miRNA所调控的靶基因，确定作用机制。从甲状腺癌差异表达miRNA中，筛选出有重要临床意义者，进一步应用过表达与RNA抑制技术，开展miRNA功能研究，鉴定出功能性miRNA，是本项目的技术关键。为此，我们拟选取至少3种甲状腺癌细胞（ATCcelllinesARO、FRO、KTC-2(derivedfromanaplastictransformedPTC);PTCcelllinesNPA、TPC-1;)FTCcelllineWRO）和3种永生化正常甲状腺滤泡细胞(如HT-ori3、HEK293T等)，分别进行miRNA过表达或miRNA抑

6、制实验，从正反多方面进行研究，可确保实验结果确切，说明问题有力。技术路线miR-121、miR-122、miR-197、miR-346、miR-17-5p和miR-19a等6个候选miRNA60例甲状腺癌组织及癌旁正常组织样本及60例良性疾病组织（每份组织临床资料齐整且均有其术前血清）该部分工作已完成详见可行性分析①定量RT-PCR检测60例甲状腺癌组织及癌旁正常组织样本及60例良性疾病组织（每份组织均有其术前血清）上述6个候选miRNA的表达量详见可行性分析②SPSS统计学软件分析筛选出1~3个与肿瘤分裂增殖、侵袭移动或不良预后相关的miRNA在甲状腺癌患者癌

7、组织中下调的miRNA甲状腺癌患者癌组织中上调的miRNA1）miRNA抑制剂分别转染3种甲状腺癌细胞（该miRNA在这些细胞中高表达），下调该miRNA的表达；2）miRNA分别转染正常甲状腺上皮细胞（该miRNA在这些细胞中低表达）使miRNA的表达量升高1）miRNA分别转染3种甲状腺癌细胞（该miRNA在这些细胞中低表达），上调该miRNA的表达；2）miRNA抑制剂分别转染正常甲状腺上皮细胞（该miRNA在这些细胞中高表达）使miRNA的表达量降低详见可行性分析③分析细胞移动和侵袭能力(Chamber移动实验和侵袭实验)分析细胞分裂增殖能力（BrdU实

8、验和克隆形成实验）详见可