金鱼PP2A-B〃家庭调节亚基β基因在胚胎发育中的功能研究.pdf

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1、分类号鱼至鱼学校代码】Q婴密级学号200814020070金鱼PP2A—B’’家族调节亚基p基因在胚胎发育中的功能研究TheFunctionResearchofRegulatorySubunit13lGeneofPP2A．B¨FamilyinEmbryonic．DevelopmentalofGoldfish／1●L，唧aSSlUSc11lrQll盖R指导教师姓名、职称奎互猩塾撞湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一一年五月摘要㈨IIIIIIIllIIIIIY191904在细胞的生命活动中，蛋白质的磷酸化与去磷酸化有着非常重要的意义。蛋白磷酸酶2A

2、(proteinphosphatase2A，PP2A)作为蛋白磷酸酶家族中十分重要的一员，它与绝大部分真核细胞的各种调控都有非常密切的关系．PP2A作为主要的丝／苏氨酸蛋白磷酸酶之一，其调节亚基对PP2A行使功能具有巨大的作用。为了研究PP2A在低等脊椎动物中的功能，我们运用RT．PCR和末端快速扩增法，从金鱼中克隆到了PP2A调节亚基B”中p基因的cDNA全长序列。结果显示，从金鱼中克隆得到的p基因包括一个含1746个核苷酸的开放阅读框和编码一个67KD的蛋白。试验中我们利用反义核酸技术研究PR72／B"／P的功能。反义核酸就是指能够与特定的m

3、RNA准确互补、特异性的阻断其翻译的RNA或DNA分子。通过使用反义核酸特异性的使某些基因的表达被降低或停止，此过程即为反义核酸技术。其包括三种技术，分别是：反义RNA、反义DNA和核酶(ribozymes)。在行使基因下向调节作用因子的功能时，反义核酶对降低一些有害基因的表达和失去控制的基因的过度表达起着非常重要的作用。与传统的基因干扰手段相比，反义核酸具有更多的优点。①高度特异性：反义核酸作用于靶RNA或DNA的原理相似于“生物导弹”，通过特异的碱基互补配对作用。②高生物活性和丰富的信息量：作为一种含有特定遗传信息的信息体，反义核酸的碱基排列

4、有着无穷的变化。③高效性：有效并且直接阻止疾病基因的转录和翻译过程。④低毒、安全：目前的研究并没有发现反义核酸的明显毒性，虽然其在体内的停留时间有长有短，但最终都会被降解。反义核酸抑制基因表达时具有广谱性，不仅可以用来抑制酶和受体蛋白，还可以用来传统方法难以起效的接头蛋白(adaptor)、结构蛋白、转录因子等。在了解PR72／B”／13在金鱼胚胎发育中的具体功能中，我们利用已经克隆到的金鱼PR72／B”／13cDNA序列，运用相关的技术构建相应的pEGFP反义表达载体，通过显微注射的方法将载体注射到金鱼的受精卵中，以观察其对胚胎发育的影响。结果

5、显示，当下调PR72／B’’／13基因的表达时，在金鱼的胚胎时期我们发现了明显的组织和器官的畸形表型。在出膜期大约有81％的绿色荧光胚胎出现畸形，在显微镜下观察我们可以发现主要表现在脊椎和尾巴的发育不全或缺失。这些结果表明，PP2A调节亚基对组织和器官的生成有着非常重要的作用，PR72／B”／13基因对于金鱼胚胎发育是不可缺少的。在下序的工作中我们对畸形的胚胎进行了石蜡切片。从切片的结果可以看出，有超过79％的畸形胚胎的眼睛有明显的畸形，其中，眼睛晶状体出现更多的纤维化，视网膜与晶状体间的间隙明显变小甚至没有，并且视网膜明显变厚。综上所述，PR7

6、2／B’’／13对金鱼胚胎的发育以及器官的形成起着不可取代的作用。关键词：金鱼，PP2A，PR72／B"／13，反义表达载体，石蜡切片ⅡABSTRACTProteinphosphorylationanddephosphorylationplayaveryimportantroleintheactivitiesofcelllife．Asakeymemberofproteinphosphatasefamily，Proteinphosphatase2A(proteinphosphatase2A，PP2A)haveacloserelationshipwi

7、thvariousregulationofalmostalleukaryoticcells．PP2Aisoneofthemajorserine／threonineproteinphosphates，everyregulatorysubunitofthemexercisesignificancestatusforPP2Afunctions．InordertoexplorethefunctionsoftheregulatorysubunitsofPP2Ainlowervertebrates，Wehaveclonedthefull-lengtheDNA

8、sequenceofthegeneencodingtheregulatorysubunitB7pofPP2Afromgoldfish，C