his标签蛋白纯化说明.doc

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1、His标签重组蛋白纯化常规方法参考目的蛋白预测等电点选择PBS或Tris-HCl溶液做为超声破碎缓冲体系，以下操作步骤以PBS缓冲体系为例：1.离心收菌1.1离心机开机预热5min，设置参数：4号转子、6500rpm、30℃、2min；1.2取诱导培养后新鲜菌液45ml左右倒入50ml离心管中，配平，离心，弃上清；1.3重复步骤1.2，至菌液内菌体全部收集于离心管中，-20℃保存。1.4保存时间不宜超过10天。2.超声破碎2.1取冻存于50ml离心管中的菌液沉淀加入25ml1×PBS移液枪吹吸沉淀

2、至悬浮；2.2冰浴，超声破碎，参数：6号超声探头，超声3s，间歇3s，功率55%，时间15min，报警温度60℃；2.3超声破碎结束后观察菌液超声前后变化，离心收集上清，离心参数：4号转子、10000rpm、4℃、10min；2.4转移上清液至50ml离心管，取上清样品28ul，加入7ul5×SDS-PAGEloadingbuffer，吹吸混匀，此样品做为超声破碎后上清样品；2.5在离心沉淀中加入25mlPBS，移液枪吹吸混匀，取沉淀样品28ul，加入7ul5×SDS-PAGEloadingbuf

3、fer，吹吸混匀，此样品做为超声破碎后沉淀样品。3.亲和层析3.1处理Ni柱固定Ni柱及废液收集器皿，流出柱内20%乙醇，加入PBS1CV清洗Ni柱。3.2上柱取超声破碎后上清溶液上柱，控制流速在150cm/h，可适当采取注射器针、移液器枪头控制流速，接取流穿液样品28ul，加入7ul5×SDS-PAGEloadingbuffer，吹吸混匀，此样品做为流穿样品。3.3洗杂取PBS配制25mM咪唑溶液1-1.5CV清洗Ni柱，接取洗杂液样品28ul，加入7ul5×SDS-PAGEloadingbuf

4、fer，吹吸混匀，此样品做为洗杂样品。3.4洗脱取PBS配制200mM咪唑溶液1CV左右洗脱目的蛋白，收集至3-4个4ml离心管中，取收集样品28ul，加入7ul5×SDS-PAGEloadingbuffer，吹吸混匀，此样品做为洗脱收集样品。3.5SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测按照《SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳SOP》操作。