谷胱甘肽标签蛋白纯化.doc

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1、GST标签蛋白纯化流程（1）装柱、平衡吸取适量GSTbeads加入层析柱中。加入15-20CV的ddw，清洗亲和柱。注入15-20CV的lysisbuffer,平衡亲和柱。（2）挂柱向平衡后的亲和柱中加入离心后的上清，使其缓慢流过GSTbeads,使标签蛋白充分与GSTbeads结合。收集流过的液体并取样。（3）洗涤用足量的lysisbuffer洗涤GSTbeads。收集流过的液体并取样。（4）洗脱Elutionbuffer洗至目的蛋白被洗出。收集流过的液体并取样。（5）SDS-PAGE检测各步骤取样。注：1）充分破菌后需要高速（16000-18000rpm）离心45-60min，上清最好

2、使用0.45um针头式过滤器过滤后再加入平衡后的亲和柱。2）lysisbuffer一般使用20MmTris-Cl，500MmNaCl，5%glycerol,pH由具体蛋白确定。或直接使用已选定的lysisbuffer。3）洗涤时，加入10-15CVlysisbuffer，可以用bradford检测穿出液是否还有杂蛋白洗出以确定洗涤的体积。如果没有杂蛋白再洗出可以停止洗涤。4）洗脱时，Elutionbuffer一般使用lysisbuffer配制。一般如果配制50ml，需要称取0.3gGSH溶解到40ml左右的lysisbuffer中，调节pH至lysisbuffer的数值后定容至50ml。G

3、SH终浓度约为0.02mol／L,酸性，记得一定要调节pH。