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1、亲合层析原理及标签蛋白纯化ContentGElifescience亲和层析原理及其用途产品专家吴云涛亲合层析的策略及技巧标签蛋白及抗体的纯化什么是亲和层析?亲和层析的主要阶段•准备亲和层析的填料亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的基质的活化:matricesthatarechemicallymodifiedtofacilitatethecoupling相互作用来分离物质的层析方法.ofspecifictypesofligand.如：抗原与抗体，受体与配体，酶与底物等。配体与基质的偶联:covalentattachme
2、ntofaligandtoapre-activatedmatrixtocreateanaffinitymedium.•平衡•上样和清洗•洗脱目标物•再平衡亲和层析的主要阶段为什么选择亲和层析?adsorptionofwasheluteoffershigh•亲和层析能够完成一般方法很难完成的分离equilibrationsampleandawayboundre-equilibrationelutionofunboundprotein(s)selectivity,henceunboundmaterialmaterial–如变
3、性和非变性的，功能不同的蛋白highresolution,•经常可以一步达到>90%的纯度andusuallyhighbegincapacityforthe•快速将目标蛋白与大量的杂质分离samplechangetoapplicationelutionbufferprotein(s)ofAbsorbance•速度快，操作简单interest>11-2cvxcv1-2cvcv1-2cvColumnVolumes(cv)1用途亲和填料•金属螯合：可反复螯合不同金属，再用已结合依赖不同金属的蛋白，一种介质可做多种纯化工作•带有
4、标签的蛋白•活化偶联：最常用的是NHSactivated4FastFlow和CNBr•酶activated4FF•单克隆和多克隆抗体•小配体亲和：GST,纯化专一性的结合丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、类胰蛋白酶等（BenzamidineSepharose）,肝素亲和填料纯化抗•DNA结合蛋白......凝血酶III，凝血因子脂酶等•任何蛋白•抗体亲和：•颜料亲和：纯化白蛋白，干扰素等•外源凝集素亲和：刀豆球蛋白A-多糖，糖蛋白等•核酸亲和•VIII因子selectandIgSelect™专用于人IgG纯化的亲和介质常用的亲和配
5、基Content配基目标蛋白洗脱条注释件螯和金属离组氨酸标签咪唑/载体:pET,pHAT,pQE,pProEx,pTrcHis,亲和层析原理及其用途子Ni2+或Co2+(PolyHis)低pH可在变性条件下纯化谷胱甘肽谷胱甘肽巯还原型载体:pGEX,pET41,pET42,可进行表达基转移酶谷胱甘蛋白的检测,融合蛋白形成二聚体(GST)肽直链淀粉麦芽糖结合麦芽糖载体:pMAL,具有MBP信号序列可进行分泌亲合层析的策略及技巧蛋白(MBP)表达,可改善溶解性双标记链霉抗生物Streptag脱硫生载体:pPR-IBA,pAS
6、K-IBA,具有OmpA信号蛋白质素蛋白变体Ⅱ(非生物素物素序列可进行分泌表达,可进行表达蛋白的Strep-化亲和)检测,进行目标蛋白的固定化,可在变性Tactin条件下纯化标签蛋白及抗体的纯化葡萄球菌抗体低pH的蛋白A/G策略理想的配基•配基与目标蛋白的特异性?①配基与待分离的物质有适当的亲和力:–Group-specificligands•尽可能简单!②配基与待分离的物质之间的亲和力要有较强•设计洗脱方案的特异性③配基要能够与基质稳定的共价结合④配基自身应具有较好的稳定性2亲和层析是一种特效技术StrategyHow
7、specificdowereallywanttobe?尽可能简单Keepitsimple!•专一特异性的配基•通用特异性的配基通用特异性专一特异性与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配基特异性不是很强，能和某•Usuallyhome-made•Oftenready-madeaffinity一类的蛋白质等生物大分affinitymediamedia•AntigenAntibody子结合的配基•Elutionprotocolsbased•Standard,testedelutionongeneralprinciples
8、protocols•HormoneReceptor•凝集素糖蛋白•ProteinGIgGantibodiesoicech•染料酶First设计洗脱方案一般的洗脱条件改变缓冲液的条件一般的洗脱方法UsuallydecreasepH,increaseionicstrengthordecreasepolarityaddin
