GE重组标签蛋白的亲和和纯化.pdf

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1、重组标签蛋白的亲和纯化GST-tagHis-tagMBP-tagStrep(II)-tagZhanyongZhao(赵战勇)ProductSpecialistofProteinSeparationGEHealthcareHotline:8008109118M:13386153366E：zhanyong.zhao@ge.com1/GE/内容1.重组标签蛋白2.GST标记融合蛋白的纯化3.His标记融合蛋白的纯化4.MBP标记融合蛋白的纯化5.Strep(II)标记融合蛋白的纯化2/GE/11.重组标签蛋白为什么重组蛋白?天然蛋白重组蛋白天然存在比较少、经过重组可以快速纯化比较困难、科

2、表达大量目标蛋白、学研究往往需要比有一套比较成熟的较多的目标蛋白。纯化方案、完全满足科研需求。4/GE/2重组蛋白应用TherapeuticsDiagnosticAgricultureRecombinantFunctionalstudiesproteinIndustrialStructuralenzymesstudiesBasicResearch5/GE/重组蛋白表达流程RNA2HNcDNACOOH2HNPlasmidHostCellCOOH6/GE/3表达系统ProcessingBacteriaYeastInsectMammaliancellscellsInclusionbodi

3、es++--Secretion+/-+--Glycosylation-+++Proteolytic+/-+/---cleavage+-=Yes=No7/GE/重组构建RecombinantL+TagProteinMediumLigandTagcleavagesiteBead8/GE/4重组构建标签配基GlutathioneS-transferase(GST)GlutathionePolyhistidineNickelions(orothermetalions)MaltoseBindingProtein(MBP)AmyloseStrep(II)-tagStrepTactin9/GE/

4、标签蛋白优势:劣势:简单亲和纯化即可实现可能需要切除标签验证方便标签可能影响蛋白结构/功能方便柱上复性增加产量(表达/稳定性)增加溶解性/折叠促进分泌/定位10/GE/5表达验证重组蛋白是否正确表达?SDS-PAGESizeandimmunoblottingProteolyticcleavageNativePAGEAggregationIEFHeterogeneityBiologicalactivityStabilityatdifferentpH,ionicstrengths,proteinconcentrationsdetergentconcentrationsN-termina

5、lsequencingTruncatedformsHeterogenousN-terminus11/GE/2.GST标记融合蛋白的纯化62.GST标记融合蛋白的纯化2.1产品-凝胶、预装柱、酶2.2纯化优化2.3应用2.1产品-凝胶、预装柱、酶GlutathioneSepharose填料分子结构谷胱苷肽通过环化反应偶联到填料的骨架上，这个配体结构是和谷胱苷肽转移酶作用位点的结构互补的。14/GE/7凝胶、预装柱2.1产品-凝胶、预装柱、酶凝胶GlutathioneSepharoseHP凝胶：是一款高效、高分辨率的，只需通过一步亲和就能纯化GST标签蛋白的凝胶。预装柱GSTrapHP

6、Columns1ml5ml15/GE/凝胶、预装柱2.1产品-凝胶、预装柱、酶凝胶GlutathioneSepharose4FastFlow凝胶：是一款高流速纯化GST标签蛋白的凝胶，比较适合放大纯化。预装柱GSTrapFFColumns1ml5mlGSTPrepFF16/10(20mlmedia)GSTMultiTrapFF(50ul/well)16/GE/8凝胶、预装柱2.1产品-凝胶、预装柱、酶凝胶GlutathioneSepharose4B凝胶：可以方便的纯化GST标签蛋白，耐压较低，流速比4FF凝胶低，载量也比4FF低。预装柱GSTrap4BColumns1ml5mlGS

7、TMultiTrap4B(50ul/well)17/GE/酶2.1产品-凝胶、预装柱、酶18/GE/9酶2.1产品-凝胶、预装柱、酶用PreScissionprotease切除GST标记的纯化流程（可在4℃操作）3.加还原谷胱甘4.加PreScission5.用HiTrap6.再把脱盐样品7.收集穿肽洗脱Protease到洗脱液中Desalting小柱脱加到GSTrap透液切开融合蛋白质盐去除还原谷胱甘FF或HP小柱肽1.加细胞裂解澄清液到GSTrapFF或HP小柱分