elp特性研究及elp标签在重组蛋白纯化中的应用

《elp特性研究及elp标签在重组蛋白纯化中的应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterTheResearchonCharacteristicsofELPandtheELP-taggedSystemforProteinPurificationByJunYuanSupervisor：Prof．Ju’eZhangDepartmentofBiochemistryandMolecularBiologyBasicMedicalCollegeApril2014万方数据学位论文原创

2、性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。⋯姗：袁泰魄训Ⅲ，日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或

3、部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。靴敝储：移日期：ⅥI唯年6月1日万方数据摘要EkP特性研究及ELP标签在重组蛋白纯化中的应用目的研究生：袁君导师：张菊娥教授郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室河南郑州450001探讨类弹性蛋白多肽(ELP)的可逆相变循环(ITC)特性，以及运用ELP作为标签对In目的蛋白进行表达纯化，观察ELP融合蛋白的I

4、TC性质以及影响其可逆相变温度的因素，以期获得ELP在更多蛋白分离纯化中的应用。方法1．ELP基因及其引物，目的基因In及ELP．In连接引物的合成，并以合成基因为模板进行扩增。2．ELP／pGEM—Teasy，ELP．In／pGEM．Teasy重组克隆载体的建立，将构建好的载体转化至大肠杆菌DH50t感受态中，涂LA固体培养基平板，挑取单克隆至LB液体培养基中培养，送去测序。3．将测序正确的单克隆菌液取少量用于提取质粒，进行双酶切后胶回收目的片段，连接至表达载体pET28b中，构建重组表达载体ELP／pET28b和ELP．In

5、／pET28b，分别将其转化至大肠杆菌DH50t感受态中进行扩增，然后提取质粒双酶切验证后，将质粒转化至大肠杆菌BL2l(DE3)感受态中，涂LK固体培养万方数据摘要基平板，挑取单克隆至LB液体培养基中培养，进而用IPTG诱导表达。4．利用WestemBlot技术分别检测ELP／pET28b，ELP．In／pET28b是否表达及其表达形式。5．将纯化的ELP．In／pET-28b蛋白用BCA法定量，稀释成浓度为1．01．tM／I_tl，分别取600Irtl于1．5mlEP管中，置于5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，3

6、5℃和40"C水浴保温15min，再分别取400肛1于比色杯中用分光光度计测OD350。相变温度Tt即为OD350最大吸光度值一半时的温度。6．ELP／pET28b，ELP-In／pET28b表达成功后，观察(NH4)2S04浓度和pH对可逆相变温度的影响，确定最合适的条件，用ITC性质分别对其进行纯化，再过镍柱后得到进一步纯化。结果1．合成ELP，In模板和相关引物，并扩增出相应的目的基因。2．ELP／pGEM-Teasy，ELP．In／pGEM-Teasy重组克隆载体经菌液PCR跑琼脂糖凝胶电泳有目的条带后送去测序正确，说明

7、重组克隆载体构建成功。3．测序正确菌种提取质粒，分别双酶切后连接表达载体pET28b转入DH5a，菌液PCR跑琼脂糖凝胶电泳有目的条带，提取质粒转入BL21(DE3)，菌液PCR鉴定有目的条带，提示重组表达载体建立成功。4．分别诱导表达后经WesternBlot检测后显示ELP／pET28b，ELP．In／pET28b均在蛋白水平上有表达，且呈可溶性形式表达。5．经分光光度计检测，检测不到ELP／FIET28b的可逆相变温度，而检测到ELP．IrdpET28b的可逆相变温度约为30℃。6．观察(NH4)2S04浓度和pH对可逆相

8、变温度的影响，根据影响因素，将ITC条件确定为(NH4)2s04为0．4M，pH6．0和Tt为25。C，ELP．1n／pET28b可得到初步纯化，再利用pET28b上的His标签过镍柱后得到进一步纯化。结论本实验成功合成融合蛋白并诱导表达出可溶性形式表达的融合蛋