重组蛋白的分离纯化.ppt

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1、重组蛋白的分离纯化基因表达体系1.原核体系2.真核体系大肠杆菌(Escherichiacoli)遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰枯草杆菌(Bacillussubtilis)分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达载体其他乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)苏云

2、金杆(Bacillusthuringiensis)真核细胞表达体系酵母细胞昆虫细胞哺乳动物细胞/组织植物细胞/组织酵母细胞可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;商品化表达体系：酿酒酵母（Saccharomycecerevisiae）;毕赤酵母(Pichiapastoris);裂殖酵母（Schizosaccharomycepombe）昆虫细胞可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的

3、表达，有加糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；作为药物宿主细胞未被FDA认可CHO细胞可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；表达量不够高，培养成本较高动物乳腺组织分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；转基因动物制作花费巨大，实验周期长鸟类输卵管组织分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；实验成本低，饲养费用低；加糖方式可能与人有所不同植物组织植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；转基因植物制作费时，

4、表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不方便体系选择研究基因功能:大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:大肠杆菌,酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产:杂交瘤细胞工业酶生产:各种微生物重组蛋白的分离纯化策略重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择针对不同的产物表达形式采取不同的策略采用分泌型战略表达重组蛋白，通

5、常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型等电点处于极端区域（pI≤5或pI≥8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和层析纯化方法的重要

6、条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-8-10-4mol/L）；疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。多种分离纯化技术的联合运用在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效

7、的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段合适分离纯化介质的选择常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉ProteinpurificationPreparationofthebacteriallysateItisacriticalstep.Optimalconditionsmaximizecelllysisandthefractionofthere

8、combinantproteinthatisextractedwhileminimizingproteinoxidation,unwantedproteolysisandsamplecontaminationwithgenomicDNA.Thelysisbuffershouldcontainastrongbuffertoovercomethecontributionofthebacteriallysate,hig