蛋白质的分离纯化.ppt

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1、第七章蛋白质的分离、纯化和表征研究蛋白质的结构、性质和活性蛋白质的功能，首先需要得到纯的、没有变性的蛋白质样品。分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括：1.分子的大小和形状、2.酸碱性质、3.溶解度、4.吸附性质5.对配体分子的特异生物学亲和力。第一节蛋白质的酸碱性质蛋白质的等电点蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保留着游离的末端α—氨基和α—羧基以及侧链上的各种功能团。蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。可解离基团主要来自侧链上的功能团.对某一种蛋白质来说，在某

2、一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点（与蛋白质所含氨基酸种类有关）。蛋白质的等离子点是特征常数蛋白质的电泳在等电点时(IsoelectricpointpI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在大于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在小于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。电泳利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离

3、纯化。第二节蛋白质分子大小的测定常用测定方法：1、根据化学组成测定最低相对分子质量2、凝胶过滤法测定相对分子质量3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量4、渗透压法5、沉降分析法（离心）一、根据化学组成测定最低相对分子质量用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子。则可以由此计算出蛋白质的最低相对分子质量。例如，肌红蛋白含铁量为0.335％，其最低相对分子质量可按下式算出：最低相对分子质量=（铁的原子量/铁的百分含量）X100=（55.8/0.335）X10

4、0=16700二、凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤原理分子筛色谱（凝胶过滤）利用Andrews的实验经验式：logMr=a/b—Ve/bVoVe（elutionvolume）为某一溶质组分的洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。V0(outervolume)为外水体积，即存在于柱床中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖—2000的洗脱体积可以决定V0。logMr三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE

5、），也称圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而成）为支持物。蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率决定于它所带的电荷以及分子大小和形状(电荷效应、分子筛效应)。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)和少量巯基乙醇，单体蛋白质或亚基的多肽链处于伸展状态，此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。结果：1、所有的SDS-蛋白质复合体都具有相同的荷质比。2、具有相同的构象。因此蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与

6、原来所带的电荷和分子形状无关。十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶的分子筛效应，电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系：logMr=a—bμR式中Mr为相对分子质量，a、b都是常数，μR是相对迁移率：μR=样品迁移距离/前沿（染料）迁移距离实验测定时，以几种相对分子质量标准物蛋白质的Mr的对数值对其μR值作图，根据待测样品的μR,从标准曲线上查出它的Mr。最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25~50*

7、104g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。s=————vω2xv=沉降速度（dx/dt）ω=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系M=——————RTsD（1－Vρ）R—气体常数（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T—绝对温度D—扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）V—蛋白质的微分比容（m3·g-1）ρ—溶剂密

8、度（20℃，g·ml-1）s—沉降系数第三节蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀一、蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。就其分散程度而言蛋白质溶液属于胶体系统。分散相质点在胶体系统中保持稳定应具备三个条件：A、分散相的质点大小在1-100nm范围内。动力学上稳定，能作不断的布朗运动。真溶液（1nm）<胶体溶液<悬浮液(100nm）B、分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉