重组蛋白分离与纯化技术 ppt!!!

《重组蛋白分离与纯化技术 ppt!!!》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、蛋白质技术专题重组蛋白分离与纯化技术Mcstonehttp://www.helixnet.cnhttp://www.helixnet.cn重组蛋白的富集原核表达（pET载体）诱导时间诱导体积（溶氧量）温度IPTG用量转速酵母表达温度时间http://www.helixnet.cn分泌蛋白质浓缩°超滤技术膜滤法，也有错流过滤（CrossFiltration）之称。基本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分子物质阻留中

2、空纤维膜包超滤管注意：截留水平温度，流速，无菌措施http://www.helixnet.cn周质蛋白质浓缩°收集菌体，重溶细胞沉淀于30mMTris-HClpH8.020%的蔗糖中。加入EDTA,pH8.0（终浓度为1mM）。加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10分钟。°离心收集细胞，去除上清液。°加入预冷的5mMMgSO4中彻底重溶沉淀，在冰上缓慢搅拌悬液10分钟。此时周质蛋白被释放入缓冲液中。°收集上清以备活性分析http://www.helixnet.cn胞内蛋白质浓缩超声波处理法用一定功率的超声波处理细胞悬液，

3、使细胞急剧震荡破裂，从而释放胞内蛋白。1.离心收集菌体，用灭菌水冲洗1-2次，混悬在少两倍体积的缓冲液中。2.将超声探头没入混悬液内，探头位于缓冲液1/3处（整个过程中探头要保持于混悬液表面），样品放在冰内，以保持低温。注意：处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。、超声破碎细菌一般不宜超过10分钟，溶液变澄清即可停止破碎http://www.helixnet.cn蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度

4、下降并先后析出，这种现象称盐析。各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。http://www.helixnet.cn影响盐析的因素1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来，即共沉淀现象。因此在盐析前蛋白质样品要加适量缓冲液稀释，使蛋白质含量在适当的范围，如2.5-3.0

5、%。除盐的方法：常用的是透析，此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。http://www.helixnet.cn透析指溶质从半透膜的一侧透过膜至另一侧的过程http://www.helixnet.cn有机溶剂沉淀法°用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但易导致蛋白质变性，应在低温下进行。°蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。°有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚

6、集而沉淀。注意：对酶活性的影响，蛋白重溶性http://www.helixnet.cn其他浓缩方法°TCA沉淀法°冷冻干燥法°PEG（6000-12000）浓缩法http://www.helixnet.cn蛋白质分离纯化的目的研究蛋白质的生物功能，需要纯品保持它的天然构相。研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性质，需要纯化的蛋白质样品。制药工业中，需要把某种特殊功能的蛋白质提纯到规定的要求，特别是要把干扰或拮抗性质的成分除去。蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度(purity)或比活(specificactivit

7、y)，以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性http://www.helixnet.cn蛋白质分离纯化的依据1.酸碱性质（带电性质）2.分子的大小和形状3.溶解度4.吸附性质5.对配体分子的特异生物学亲和力http://www.helixnet.cn层析原理°层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。°层析因固相介质不同又分为离子交换层析、疏水层析、分子筛层析和亲和层析等各种层

8、析。http://www.helixnet.cn纯化流程http://www.helixnet.cn离子交换层析原理：等电点。同等电聚焦电泳一样，离子交换层析利用不同蛋白质表面电荷性质的不同达到分离、纯化蛋白质的目的。当pIpH时，蛋白质带净正电荷。离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）