蛋白质分离纯化与检测技术

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1、蛋白质分离纯化与检测技术聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和交联剂亚甲双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素(C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同分子的迁移率，当施加一定电压时小分子的物质的迁移速率将快于大分子的物质，即所谓的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳原理蛋白质并非线形的，它存在二级结构、三级结构及四级结构蛋白质分子所带的电荷不同分离蛋白质解离成单个多肽亚基

2、并可能尽可能减少期间的相互间的聚集消除蛋白质分子形状的影响掩盖不同类蛋白质分子原有的电荷差别蛋白质分子与一种带电荷非常多的物质结合蛋白质分子的电泳迁移率与分子量成线形关系聚丙烯酰胺凝胶电泳原理在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品与上样缓冲液混合变性，上样缓冲液中含有SDS和巯基乙醇使得蛋白质分子中的二硫键还原，氢键、疏水键打开，SDS按1.4gSDS/1g蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链分子上，形成SDS-多肽复合物。由于十二烷基磺酸根带负电，SDS覆盖于蛋白质的表面，破坏了蛋白质分子的四级结构而使多肽复合物具有近似的形状（长椭圆棒状），并且复合物所带有的负电荷大大超

3、过了多肽分子原有的电荷量，因而掩盖了多肽分子原有的电荷差别。聚丙烯酰胺凝胶电泳原理如图所示，蛋白质所带的电性主要取决于氨基酸R集团所带的电性。图中的H代表无极性的R集团为了躲避水而聚集于内部。当SDS结合到蛋白质多肽链分子上，形成SDS-多肽复合物后，SDS均匀覆盖于蛋白质的表面，破坏蛋白质分子的疏水作用而成为线性分子。SDS-聚丙烯酰胺凝胶使用一种不连续的缓冲系统。在这一系统中，一般凝胶分为低浓度的成层胶（浓缩胶）和较高浓度的分离胶。在电泳时，SDS-多肽复合物向两胶界面迁移，在分离胶表面形成了一个极薄的层，极大地浓缩了样品的体积，使样品在分离之前处于同一起跑线。试剂

4、30%凝胶贮备液：含29%（W/V）丙烯酰胺1%（W/V）N，N-亚甲双丙烯酰胺10%SDSTEMED（N，N，N′，N′-四甲基乙烯二胺）10%过硫酸胺Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mmol/LTris250mmol/L甘氨酸（pH8.3）0.1%SDS1.5mol/LTris•Cl(pH8.8)分离胶1.0mol/LTris•Cl(pH6.8)浓缩胶表3.4分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质10420-301-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-105×1052-5核酸(RNA)10415-20

5、104-1055-10105-2×1062-2.6蛋白质的分离纯化InvitrogenProbondTMPurificationSystem分离纯化原理金属螯合层析：在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与金属离子如Ni++螯合后，可与生物分子如蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从而将蛋白质分离。ProBond™是一种带有正电荷镍离子的琼脂糖树脂，带有6×His标签的蛋白与固定在ProBond™上的二价镍离子具有高度的亲和性，用某种与吸附蛋白质竞争结合的溶质洗脱亲和基质，特异性地将吸附的各种蛋白质分别洗脱下来。这类溶质包括含-NH2、-

6、COOH、-SH等基团的物质和咪唑等取代剂。带有His•Tag蛋白质分子分离纯化原理咪唑分离纯化原理操作流程一、柱子的制备二、蛋白的纯化一、柱子的制备将装有树脂的瓶子不断的颠倒轻敲，使树脂在瓶中重悬。吸取2ml树脂加入纯化柱中，静置5-10分钟，通过重力使树脂沉淀在柱底；也可以通过低速离心（800×g,1min）的方法使树脂沉淀在柱底,轻轻吸去上清液。吸取6ml无菌蒸馏水加入柱中，不断的颠倒轻敲，使树脂在柱中重悬。重复步骤2。在柱子中加入6mLNativeBindingBuffer。不断的颠倒轻敲，使树脂在柱中重悬。重复步骤2。重复步骤5-7。二、蛋白的纯化吸取8ml溶

7、解产物加入已经制备好的纯化柱中。轻轻滚柱子动使树脂在溶解产物中保持悬浮状态，使带有组氨酸标签的蛋白与树脂充分结合，此过程30-60min。通过重力或低速离心（800×g）的方法使树脂沉淀在柱底，轻轻吸去上清夜,上清液于4℃储存并做SDS-PAGE分析。用8mlNativeWashBinding洗涤，通过重力或低速离心（800×g）的方法使树脂沉淀在柱底，轻轻吸去上清夜,上清液于4℃储存并做SDS-PAGE分析。重复步骤4三次以上。夹紧柱子，使柱子与地面保持垂直，将柱子底端的帽折断，用8-12ml的NativeElutionBuffer洗脱