重组蛋白2SH2的表达、纯化、结构分析及应用

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1、浙江理工大学硕士学位论文重组蛋白2-SH2的表达、纯化、结构分析及应用姓名：武烨申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：郭江峰20090308白经凝血酶酶切及纯化后经SDS—PAGE电泳检测，结果显示GST-2一SH2融合蛋白、GST融合蛋白标签和2-SH2蛋白表达纯化结果良好，分子量大小与预期值一致，分别为51．7kDa,26kDa和25．7kDa。纯化后的2．SH2蛋白样品用于Western．blotting和质谱检测。Western-blotting结果表明纯化并酶切后的蛋白样品能够与兔抗小鼠SHP．2／SHP

2、TP一2多抗特异性识别结合，在目标区域出现特异性杂合条带。SELDI—TOF—MS检测结果显示被检测蛋白分子量为25．7kDa，与理论值(25．66kDa)相一致。经过一系列检测确认的2-SH2蛋白样品经浓缩定量后进行核磁共振结构检测。NMR三维结构和活性位点的分析结果表明，目的蛋白正确折叠并呈规则的空问结构。综上所述，经上述表达纯化方法获得的蛋白具有天然的折叠结构，可以应用于蛋白结构域芯片和靶向药物的开发。经此方法获得的高质量2-SH2结构域蛋白可作为np临床检测的新型诊断芯片材料。同时2一SH2蛋白结构域芯片还可以作为2．SH

3、2-pY-EPIYA-D型复合物的自然筛选器，用于该复合物结构和作用机制的研究。这些作为基础，为将来新型蛋白结构域临床诊断芯片和靶向抑制药物的开发提供支持。关键词2-SH2；表达；纯化；Westernblowing；表面增强激光解析及电离飞行时间质谱；核磁共振ⅡAbstractHelicobacterpylori∞)istheprimarypathogenicbacteriumofgastriccarcinogenesis，gastricadenocarcinoma,chromcgastricmucosalinflammation

4、，peptieulcer,gastriculcerandduodenalulcer．C啦proteinwhichisoneofthevirulencefactorsofHpcouldinteract诵Ⅱlsignalconductingmoleculesofhostcell，inducingsomepathologicalcellularresponses，suchasincreasingcellproliferation，motility,apoptosisandmorphologicalchange．SHP一2isatypic

5、alsignalingprotein，whoseincorrectactivationmaywellexplainitspathogenesismechanism．CagAplayscmcialrolesinsomehumandiseaseswhichcausedbytheHp．When丑pyloriinfectedgastricepithelialcells，cagAproteincouldbeinducedtyrosine-phosphorylated．Manyofthetyrosine·-phosphorylatedcagA

6、moleculesassembledaroundSHP-·2acceleratingitsactivation．Consequently，signaltransductionpathwayswereaccordinglyaltered．SI-12(srchomology2)domainsaregenerallyexistinginhighereukaryotesandinyeast．Sofartherehavebeenapproximately120proteinsincludingSHP一2discoveredwiththeSH

7、2structuredomains，whichwerecomposedofapproximately100aminoacids．DifferentSH2domainsCanbeincludedinaseriesofproteinswithextremelydifferentfunctions．ManySH2domain-containingproteinsactedasdockingsitesfortheformationofmultiproteincomplexes．SHP一2includestandemamino—termin

8、alSH2domains(2一SHE)．The2一SH2consistsof213aminoacidsincludingN—terminal—SH2(N—SH2)of102aminoacidsandC—terminal-SH2(C—SH2)of10