基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析

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1、基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析重组蛋白的表达表达体系：表达载体原核受体细胞真核选择表达载体常用的关键元件：启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子。）融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等。如多聚His标签－6×His，便于镍柱亲和层析纯化。GST融合蛋白用GST柱亲和层析）分泌信号筛选标记其它6×His重组蛋白的纯化亲和层析离子交换层析凝胶过滤层析……本单元实验流程：细菌（pEF-GFPuv）亲和层析IPTG诱导细菌总蛋白重组蛋白融合蛋白乳糖操纵子的特性SDS-PAGE初步分析实验十重组DNA

2、在大肠杆菌中的诱导表达实验目的实验原理材料与试剂实验仪器操作步骤注意事项实验安排思考与讨论实验目的了解和掌握IPTG诱导表达的原理。了解降解物阻遏的现象及其机理。实验原理操纵子是基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成。乳糖操纵子的诱导表达当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使结构基因不能转录，也

3、就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态。乳糖操纵子的诱导表达（续）当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3’端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导。乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。乳糖操纵子的诱导表达（续）本实验所使用的表达载体上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因为绿色荧光蛋白基因

4、。在IPTG的诱导下，目的基因表达可增强105倍。然而，诱导表达常常受到温度和诱导物的影响。乳糖操纵子的降解物阻遏当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有当葡萄糖耗尽后，细菌才能充分利用乳糖，这种现象称葡萄糖效应，其实质是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解物阻遏（catabolicrepression）。乳糖操纵子的降解物阻遏（续）降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白（CatabolitegeneActivationProtein，CAP），又称cAMP受体蛋白（cAMPReceptorProtein

5、，CRP）属于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合到CAP结合位点上，促进转录。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制转录。阻遏蛋白负调节与CAP正调节的协调当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；而没有CAP存在时，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。只有在CAP存在且没有阻遏蛋白与操纵序列结合时，或者说只有高乳糖低葡萄糖时，操纵子发挥最大转录活性。这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致

6、。Thestructureoflacoperon调节序列结构基因Repressorandnegativeregulation异乳糖异丙基硫代半乳糖苷异乳糖CAPandpositiveregulation低乳糖时高乳糖时在协调调节下，lacoperon的强诱导作用发生在高乳糖、低葡萄糖的状态。材料与试剂材料含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质粒工程菌。试剂LB液体培养基：蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeastextract）5g、NaCl10g，加800mL双蒸水溶解，用10MNaOH调pH至7.2-7.5，定容至1000mL。分装

7、，高压灭菌，4℃保存。氨苄青霉素溶液：无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，-20℃保存，使用终浓度为50μg/mL或100μg/mL。IPTG溶液：将238.3mgIPTG溶解于10mL双蒸水，0.22μm细菌滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用，贮存浓度为100mM。20%葡萄糖溶液：20g葡萄糖溶解于适量双蒸水，定容至100mL，121℃，15min灭菌，4℃保存。实验仪器超净工作台、恒温摇床、离心机等。操作步骤挑取含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉（终浓度为100μg/mL，以下同)的5mL的LB培

8、养基中，于37℃、250rpm过夜培养12h-14h至对数生长期。取3支已灭菌的大试管，分别加入5mL含有氨苄青霉素的LB