蛋白纯化层析柱--ge 详细介绍

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1、蛋白纯化层析柱2011-06-1515:19:14易生物仪器浏览次数：1164网友评论0条　　从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是...关键词：蛋白离子交换分离分子物质树脂　　从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为

2、这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术（gelfiltration，GF），离子交换层析技术（ionexchange，IEX），羟基磷灰石层析（hydroxyapatite，HAP）和疏水作用层析（hydrophobicinteraction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performanceliquidchromatography，HPLC）。　　对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些

3、流程都已经逐步系统化了。GEHealthcare（原AmershamBiosciences）的技术顾问AndrewMitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步：　　捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白；　　区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白；　　修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。　　这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。　　第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量（flow

4、rate）的填料。bead大小比较大，范围比较宽（比较于bead大小平均值）的“fastflow”填料比较理想，这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。　　第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常bead的大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的bead比较合适。吸附性的技术，比如离子交换IEX和疏水作用HI通常被用在纯化的这前两个步骤，而凝胶过滤则会留到了最后的修饰那一步，用于小体积，高浓度的样品。另外要注意，进行凝胶过滤层析时，样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。　　选择柱料

5、的时候有两个因素要考虑到，针对目的蛋白的选择性和有效性——这些可以由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力，IEX和HI层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用，而GF的选择性依赖于填料的分馏范围（fractionationrange）。　　柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力，Mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比较宽，那么即使是选择性很好，分辨率仍然会被消弱”。bead越大，洗脱峰就越不集中，柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性，高选择性和高效

6、性的结合就会得到高分辨率。　　凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)　　凝胶过滤法（gelfiltration）也称为排阻层析（exclusionchromatography）、凝胶层析（gelchromatography）或分子筛层析（molecularsievechromatofraphy），它是在1960年后发展出来的技术。　　凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可

7、以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。　　目前常用的凝胶包括3个主要类型：　　1.Polydextran　　Polydextran的商品名称是Sephadex，它几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型号，如G-25、G-75

8、、G-100或是G-200，G后面的数字为凝胶吸水量再乘以10，以G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5ml。　　GE的SephadexG-25柱就是这一系的产品，十分适合于快速处理不同体积的样品，可以用在层析纯化的前、中、后的任一阶段，即适用于实验室操作，也