His蛋白大量纯化

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1、1）构建克隆2）转化BL21codonplus，先小摇50mlBD管子，双抗，0.3mMIPTG，25℃，5h（经验值），检测蛋白表达情况，3）挑单克隆于100ml培养基中（250ml瓶），至菌液浑浊4）大摇2.5L，分5瓶（2L），每瓶500ml（上限），每瓶加15ml菌液，单抗，测其OD值，至OD600在0.6-1.0之间，取菌液1ml(每瓶200μl)，0.3mMIPTG，25℃，5h5）Lysisbuffer配制：用50mlBD管子，加5mM(1-5mM)咪唑（5M储液，PH8.04℃避光）除去非特异性，1mMcocktail，PM

2、SF要多加（3-4倍），不可加DTT（对镍柱不利）、二价离子将菌体取出，融化，按1L菌液加30mllysisbuffer的比例，将菌体充分悬浮（注意吹打时将吸管插入液面以下，减少气泡的大量产生），可分次加入，将菌体转移至BD管子中，转移干净菌体悬起后，加入1%Triton，1mg/ml的溶菌酶（1:100，可不加），转移至100ml小烧杯中，超声处理（一般200W，15+152000s）(注意墙头插入液面以下，避免大量气泡的产生)，此时菌液由粘稠变得一滴一滴6）将超声后的菌液转入50ml大抽离心管中，配平，18000rpm30min或140

3、00rpm15min2次7）Beads处理（可在超声过程中进行，Beads不能干）：2L菌体加4mlbeads，取8ml于15mlBD管子中，500g3min（1000rpm5min），用不含任何东西的lysisbuffer重悬，Wash2-3次（10倍Beads体积），洗去乙醇，之后分成两份用lysisbuffer浸没，置于4℃冰库或冰上1）将上清转入50ml管子中，将Beads也转入，留少许上清洗Beads，转移干净，4℃2h，孵育好后，将管子取出，静止一段时间，让Beads沉淀，缩短后面过柱子的时间2）先将上清转入柱子中，再将Bead

4、s也转入，4℃，让液体流出，回收存放3）先用10mM咪唑的Lysisbuffer洗涤（总体积100ml，前50ml加1mMPMSF）（洗涤期间可轻轻吹打Beads），再用20mM咪唑的lysisBuffer洗涤（总体积100ml，不加PMSF）（PMSF影响抗体制备），Wash总体积是Beads的50倍。期间，取20mM咪唑的lysisbuffer（Blank）和洗涤下来的液体（Sample）测OD280，使其<0.014）洗涤完后，将柱子下端口封住，用300mM（250mM-500mM）咪唑的lysisbuffer洗（ElutionBuf

5、fer），沿壁加，EP管接收，每管大约1ml，用bradford测每管浓度。留下蛋白含量最高的管，呈黄绿色，堵上出口，加ElutionBuffer浸泡Beads5）PD10脱盐柱洗脱咪唑：先将保护液倒掉，5ml*5PBSWash，将洗脱液按由高到低的浓度梯度，2.5ml一组加入PD10柱子中，再加3.5mlPBS洗脱，一般前0.5ml不含蛋白，用bio-rad检测后丢弃，接下来2.5ml要收集，后面0.5ml咪唑较多归入下一组6）大约3-4PD10管收集后，用bio-rad测浓度（BSA对照）1）考染再次测浓度，此时样品和BSA都做梯度，2

6、）将样品500μl分装，做好标记，-80℃存放，预定时间，二楼冷冻抽干配制50mMNaH2PO4,300mMNaCl储液（A），1Mimidazoleph=8.0储液Lysisbuffer:A+1mMimidazole,ph=8.0,用前加1%tritonx-100,1mMPMSF,cocktailWashbuffer:A+10-20mMimidazole,ph=8.0,用前加1mMPMSFElutebuffer:A+250-500mMimidazole,ph=8.0