His-Tag蛋白纯化步骤

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1、变性条件下从大肠杆菌中纯化多聚组氨酸标签蛋白（主要以包涵体的形式表达）的样品制备1、用1×PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5ml1×PBS），并按上述方法进行超声破菌。2、12000rpm离心10min收集包涵体。若有必要，用1×PBS洗包涵体几次。3、用Binding/WashBuffer（约每毫升沉淀加5ml1×PBS）溶解包涵体，并在室温下孵育30～60分钟。若使沉淀充分溶解，有必要进行机械或超声均质。4、12000rpm离心30min，取上清至一干净管中。His标签蛋白的重力纯化流程1ml柱子的总体积为10ml，只需加入介质。如果

2、样品体积大于柱子体积，可重复利用，注意不要超过树脂的结合能力。1、平衡柱子的工作温度。应在室温或4℃下进行纯化。2、取出底帽，倒出多余的液体，直立固定好柱子，让柱子顶部朝上。3、用2倍树脂体积的Binding/WashBuffer平衡柱子，以0.5～1ml/min的流速过柱。4、从柱子上部加入经Binding/WashBuffer处理的大肠杆菌裂解物或蛋白提取物，收集流出液。若需要，让流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。5、用两倍树脂体积的Binding/WashBuffer洗涤树脂并收集流出液。重复该步骤，用一新的收集管收集流出液

3、。直到流出液的吸光度在280nm基线处。6、用两倍树脂体积的ElutionBuffer将His标签蛋白从树脂上洗脱下来。重复此步骤两次，并单独收集每次洗脱出来的液体。7、用ModifiedCoomassieBradfordAssayKit（NoSK3041）。洗脱的蛋白可直接进行SDS-PAGE分析。注意：洗脱获得的蛋白可用凝胶过滤（如NoBSP090gravityDesaltingColumn）或透析去除咪唑以便后续应用。SDS-PAGE分析前，含6M盐酸胍的样品必须用含8M尿素的缓冲液透析。就地清洗方案如果背压增加或观察到树脂明显污染，

4、通常进行完全性能恢复流程。由于所有的NI-IDA树脂的高螯合强度和低金属浸出率，就地清洗前不需要进行stripping。我们建议使用下面的方法，以清除污染物，如沉淀的蛋白、疏水结合蛋白和脂蛋白。程序1、用15倍树脂体积的0.5MNaOH清洗柱子。考虑到需要30min的接触时间，因此需相应地调整流量（如用0.5MNaOH溶液以0.5ml/min的流速洗1ml的NI-IDA柱，需要相当于15ml总体积的量）。2、用10倍树脂体积的1×PBS重新平衡后，树脂可马上使用。若要保存柱子，可加入20～30%乙醇或10～100mM氢氧化钠进行4℃保存。通

5、过洗脱（stripping）和离子重填装进行再生NI-IDA柱的洗脱（stripping）和再填装通常是没有必要的。如果背压增加或观察到树脂明显污染，就地清洗过程通常可恢复性能。但若性能仍不令人满意，柱子内的NI-IDA树脂可用下面的程序进行洗脱（stripping）和离子重填装。程序1、用10倍树脂体积的洗脱缓冲液（StrippingBuffer）（50mM磷酸钠；300mMNaCl；100mMEDTA，pH值8.0）洗涤树脂。2、用20倍树脂体积的去离子水清洗树脂。3、用2倍树脂体积的100mMNiSO4（用去离子水配制）进行离子再填装

6、。4、10倍树脂体积的去离子水清洗，并用10倍树脂体积的1×PBS重新平衡树脂，树脂可马上使用。若要保存柱子，可加入20～30%乙醇或10～100mM氢氧化钠进行4℃保存。问题解答问题可能的原因建议流速太慢样品太黏l如果纯化是在4℃进行，那改为在室温下进行。l超声破菌前或超声破菌后增加细胞裂解物的稀释度。l继续超声破菌，直到黏度下降；和/或额外加入DNAse和Mg2+。l如果用很黏稠的溶液，将柱子连接到真空管以增加流速纯化过程中目的蛋白难溶或沉淀l添加去垢剂或其他物质，缓慢混合30min以增加目的蛋白的可溶性。注意：TritonX-100和

7、NP-40（不是Tween）在280nm具有高吸光度，此外，去垢剂不能通过缓冲液置换而轻易去除。l包涵体：用常规变性剂如4～6M盐酸胍、4～8M尿素或强变性剂，蛋白很容易从包涵体中溶解（和去折叠）。缓慢混合30min或更长时间以助溶目的蛋白。His-Tag蛋白产量低His-Tag蛋白没有完全被洗脱l额外增加几毫升的elutionbuffer进行洗脱样品制备和洗涤过程中发现流出液中存在His-Tag蛋白l样品和结合缓冲液中咪唑浓度太高，使用低浓度的咪唑。l确定样品中螯合剂或强还原剂的浓度不要太高。l组氨酸标签可能暴露不充分；对包涵体，可用尿素

8、或盐酸胍对去折叠的蛋白进行纯化。减少样品的稀释，增加固体尿素或盐酸胍。l组氨酸标签丢失。检查结构的序列。纯化过程中His-Tag蛋白没有被洗脱下来lHis-Tag蛋白仍然被结合。