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1、Ni柱纯化His-tag蛋白质一非变性条件下抽提His-Tag蛋白质下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾（HisTagProtein）的具有天然结构的可溶性重组蛋白质（NativeProtein）。其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有His-Tag结构，提供的层析方法可供参考。1.样品准备1)准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mMIPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。2)加入1/20细胞生长体积的NTA-0Buffer（20mMTris
2、-HClpH7.9，0.5MNaCl，10%Glycerol）和PMSF。PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。该步骤冰上操作。3)将细胞悬浮起来，加入溶菌酶（工作浓度位0.2-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶），混匀，冰上放置30分钟，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。4)加入10%TritonX-100,使Triton的终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟，间或混匀）；冰上超声破碎细胞，同时降低粘稠度。5)加入1M
3、MgCl2，使MgCl2的终浓度为1mM，混匀。加入DNase,使DNase的终浓度为10mg/ml，混匀，室温放置10分钟。6)5000转/分（20,000xg以上），4度离心15分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20度保存。2．层析1)将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗。2)将样品（步骤2（6））加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。3)层析用5倍NTA体积的NTA-0Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。4)分别用5倍NTA体积的NTA-20，NT
4、A-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000Buffer洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。5)确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用BBST的Bradford蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。6)目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。附溶液配方：NTA-0Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glyc
5、erol,NTA-20Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,20mMImidazole(咪唑)NTA-40Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,40mMImidazole(咪唑)NTA-60Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,60mMImidazole(咪唑)NTA-80Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,80mMImidazole(咪唑)NTA-100B
6、uffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,100mMImidazole(咪唑)NTA-200Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,200mMImidazole(咪唑)NTA-1000Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,1000mMImidazole(咪唑)二变性条件下从包涵体中纯化His-Tag的蛋白质有些蛋白质细菌或其他细胞中表达效率很高，但溶解性很差，通常形成包涵体。这些蛋白质的溶解通常需要用盐酸胍或尿素。与MB
7、P和GST的亲和层析材料相比，NTA树脂可以在6M的盐酸胍存在的情况下与具有HisTag的蛋白质结合。整个层析过程都是在有盐酸胍的条件下进行。纯化后的蛋白质需要进行复性，正确复性的蛋白质才具有生物学活性。下列方法（步骤4-5）用于从细菌中抽提含His-Tag位于包涵体变性蛋白质。1．样品准备1)准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mMIPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。2)加入1/20细胞生长体积的GuNTA
