Ni-柱纯化蛋白步骤.docx

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1、蛋白过镍柱纯化的原理：Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有HIs(组蛋白)标签的碱性蛋白蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸(碱性氨基酸)。在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以也可以与咪唑结合这时候再用咪唑洗脱，梯度洗脱，咪唑竞争性结合到硫酸镍上，目的蛋白就被洗脱了，这时候收集浸出液，那么里面就是你要的目的蛋白，然后透析掉咪唑就行了。准备材料：各种buffer，Ni-柱以我纯化一个蛋白Iso为例，其最适buffer的pH为8.0，对应各

2、种纯化buffer如下，我习惯实验前都配好。Lysisbuffer:20mM Tris-HClbuffer,100mMNaCl,10%(v/v)glycerol,7mM2-ME,pH8.0.Washbuffer:20mM Tris-HClbuffer,100mMNaCl,10%(v/v)glycerol,7mM2-ME,20mMimidazole,pH8.0.Elutionbuffer:20mM Tris-HClbuffer,100mMNaCl,10%(v/v)glycerol,7mM2-ME,25

3、0mMimidazole,pH8.0.Savingbuffer:20mM Tris-HClbuffer,100mMNaCl,10%(v/v)glycerol,7mM2-ME,pH8.0.步骤：1.甘油管保存菌种接种3mLLB试管，37℃，250rpm，培养12hr。2.第二天，接种1%种子液至100mLLB/500mL锥形瓶，37℃摇床培养至OD600=0.6~0.8，加入0.4mMIPTG诱导（对于BL21(DE3)/pET-28a-XX来说），30℃，250rpm，6hr。3.6,000*g，4

4、℃，离心10min，收集菌体。4.加入10mLlysisbuffer重悬菌体。5.超声破碎：超声时间3s，间隔时间5s，功率200W，超声5min。6.13,000*g，4℃，离心10min。上清液转移到新离心管中，用0.22um或0.45um的滤膜过滤，样品上清液上Ni-柱。（注意纯化的温度，如果蛋白对温度敏感，需在4℃纯化）7.待样品上清液大致流净，加入washbuffer洗杂蛋白，一般需要10~15倍柱床体积的Washbuffer，用CoomassieG250检测杂蛋白是否洗干净。8.如Coo

5、massieG250不变色表示杂蛋白已经洗干净（一定要接最新流出的液体检测），加入2~3倍elutionbuffer洗脱目的蛋白，此时开始收集目的蛋白，并用CoomassieG250监测收集。9.将收集的蛋白溶液转移到透析袋中，透析袋扎紧，放置1~2Lsavingbuffer中透析蛋白。如加搅拌，透析约2~3hr完成。透析需在4℃完成。10.收集透析后的蛋白，进行SDS-PAGE检测纯化蛋白的纯度（也可在步骤8中进行检测），并用Bradford方法测定蛋白质浓度。11.进行酶活实验。