his-gfp蛋白的纯化步骤

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1、以His-GFP为例简述His-tag蛋白的纯化His-tag是重组蛋白中最常用的融合标签之一。使用镍柱纯化His-tag融合蛋白的原理为：组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。实验中一般选用6个组氨酸（His6-tag）的标签。His6标签有许多优点：（1）由于只有6个氨基酸，分子量很小，对蛋白结构和活性的影响较小，一般不需要酶切去除；（2）可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力；（3）His6标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。Hi

2、s6标签也有一些不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落，混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。本实验将以His-GFP（绿色荧光蛋白）为例，阐述His-tag蛋白的纯化过程。1.E.coli重组菌体破碎表达完成的E.coli重组菌体，经超声或细胞破碎仪进行破碎。当需要破碎的细胞沉淀较少（＜1g）时，通常在Eppendorf管中，用超声法完成细胞裂解。而当细胞沉淀较多时，可选用细胞破碎仪进行破碎。本实验采用细胞破碎仪法。细胞破碎仪法：称量细胞沉淀的湿重，加入细胞湿重

3、10倍体积的裂解缓冲液。如，1g细胞沉淀加入约10ml的裂解缓冲液，使得细胞在溶液中的终浓度为10-15%，在此范围内细胞破碎的效果较好。过浓或过稀的细胞浓度均不利于破碎效率。裂解缓冲液的组成如下：Lysisbuffer：20mMTris-HCl,pH7.4100mMNaCl10mMimidazole0.1%TritonX-1001×proteaseinhibitor将细胞沉淀在裂解buffer中充分搅拌至没有结块后，进行高压破碎。细胞破碎仪的使用方法：首先加水至规定线后，开压缩机，将冷却水制冷至4oC，方可使用。本过程可能要要持续20min左右。待水冷却至4oC后，开始破

4、碎。为保证破碎效果，一般重复三次。破碎完成后，一定要卸压、放水、清洗样品槽。1.离心细胞裂解液15000rpm、4oC离心45min，去除细胞碎片。离心完成后，得到的上清即细胞裂解液上清用来做进一步的纯化。对于GFP来说，由于折叠好的GFP本身具有颜色，因此可以通过颜色来判断在细胞裂解液上清、沉淀中是否具有GFP。在本实验中，ml的培养物最终得到了g的细胞沉淀，加入ml的裂解缓冲液，最终得到ml的细胞裂解液上清。2.His-GFP蛋白的纯化Nisepharose6FF凝胶的预处理：在直径2.5cm的层析柱中装入适量的凝胶。本实验中选用2ml凝胶（CV=2ml）。待液体流完后

5、，分别用5CVH2O和5CV平衡缓冲液处理凝胶。平衡好的凝胶以待使用。平衡缓冲液的配制：20mMTris-HCl,pH7.4100mMNaCl10mMimidazole吸附：将平衡好的凝胶加入到细胞裂解液上清中。将此混合物在4oC层析柜的混匀器上混匀30min。装柱：将层析柱的下端打开，让未结合的蛋白随液体流出，收集流穿（flowthrough）。如果GFP完全吸附到柱子上，那么流穿中应该没有颜色，而柱子上应该有较重的黄绿色。流穿中的黄绿色越重，说明蛋白的吸附不理想。这种情况下，需要考虑调整平衡缓冲液的pH、NaCl的浓度、咪唑的浓度；以及吸附时间、细胞裂解液上清：凝胶的体

6、积比等。洗脱非特异吸附的蛋白：用10ml的10mMimidazole（溶解在20mMTris-HCl,pH7.4，500mMNaCl中）洗脱非特异吸附的蛋白，自然流速洗脱，每1ml一收集。目的蛋白的洗脱：分别用10ml的50mM、250mM、500mM的imidazole（溶解在20mMTris-HCl,pH7.4，100mMNaCl中）洗脱目的蛋白，自然流速洗脱，每1ml一收集。洗脱级分的检测：10%SDS-PAGE检测各洗脱级分。镍柱的清洗：如果柱子上仍有残留的蛋白或者是脂类等物质未被洗脱下来，可以用2MNaCl或0.5MNaOH在自然流速下洗2cv，然后用5cvH2O

7、继而5cv平衡缓冲液冲洗。镍柱的再生：如果镍柱已使用超过5次，或明显可看到镍柱颜色变浅，或纯化其它蛋白担心引起交叉污染，可对镍柱进行再生，程序如下：1）5cvbindingbuffer2）5cvEDTA（in20mMTris-HCl，pH7.4，500mMNaCl）3）5cvH2O4）5cvbindingbuffer5）2cv0.1MNiSO46）5cvH2O7）5cvbindingbuffer此时，柱子再生完毕，可继续使用。蛋白纯化中应注意的事项：1.缓冲液的选择：应根据目标蛋白的pI值和pH稳定性等条件来选择。