B族链球菌核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法).doc

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1、B族链球菌（GBS）核酸检测试剂盒样本要求1.样本采集：采用藻酸钙、普通棉拭子或涤纶拭子采集生殖道或直肠等部位带上皮细胞的分泌物标本。2．标本存放：待测样本在2-8℃保存不应超过24小时；-18℃以下保存不超过4天。样品冻融6次以内无影响，但应尽量避免反复冻融。3．标本的运输条件：冷冻4天内无影响，冷藏2天内无影响。4.含血样本无法正常检测应避免。5.研究显示，常用栓剂药物会对试剂检测盒造成较大影响，因此取样前应避免该药物的使用。检验方法1.DNA提取（在样品处理区操作）（1）妊娠34—37周孕妇生殖道或直肠分泌物：取含有分

2、泌物的生理盐水1ml，13000rpm离心10min，弃上清液，沉淀，加无菌生理盐水1ml混匀，13000rpm离心5min，弃上清。沉淀加入50μlDNA提取液充分混匀，99℃—100℃加热处理10min，13000rpm离心10min，吸取上清至1.5ml离心管中保存，DNA提取完毕。（2）GBS阳性对照品提取：取50μlGBS阳性对照品加入1.5ml离心管中，13000rpm离心10min，沉淀加入50μlDNA提取液充分混匀，99℃—100℃加热处理10min，13000rpm离心10min，吸取上清至1.5ml离心

3、管中保存，DNA提取完毕。（3）空白对照品提取：同GBS阳性对照品提取。2.GBSPCR反应液配制（在试剂准备区进行）解冻试剂，在打开盖子之前振荡并短暂离心个试剂管。按标本数量分装GBSPCR反应液。按每管35μl分装至0.2mlPCR反应管中，转入样品处理区。3.加样（在样品处理区进行）分装好的各反应管加入处理好的DNA样本5μl，阳性对照品5μl及阴性对照品5μl，短暂离心使所有试剂集中到反应管底部，确定盖好管盖或封膜后，立即进行PCR扩增反应。4.PCR扩增（在PCR检测区进行）（1）UNG反应：50℃2min（2）预

4、变性：95℃5min（3）PCR：45个循环；60℃时分别检测FAM和HEX通道荧光信号，选择反应体系40μl.5.阈值测定阈值设定在空白对照正常扩增区线下方，基线设定可选择3-5个循环，一般选择5.00，若是最高浓度Ct值小于5.00，则在3-5之间按照低于最高浓度Ct值设定；这类标本应稀释后再进行检测。6.质量控制7.检测结果和判定（1）阴性标本结果判定：如果FAM通道无Ct值显示，而HEX通道信号正常，则样本为阴性。（2）阳性标本结果判定：a).Ct≤38.00，则样本为阳性b).若样本的38.00

5、应重试，若结果仍为38.00