乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)操作说明.pdf

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1、乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒【储存条件及有效期】-20℃保存12个月。探针若单独储存，应注意避光。（PCR-荧光探针法）操作说明【适用仪器】【产品名称】本品适用于AB7300/7500/Mx3000P/LightCycler480/SLAN实时荧光定量PCR仪。通用名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)【样本要求】英文名称：DiagnosticKitforQuantificationofHepatitisBVirusDNA(PCR-FluorescenceProbing)用一次性的针筒抽取病人静脉血1ml，置于灭菌的一次性试管中室温自

2、然凝固或800～1600g离心20分钟，取分离出的【包装规格】血清0.2ml左右送检。血清标本2～8℃可放置72小时，-70℃可长期保存，标本不宜反复冻融。32人份/盒【检验方法】【预期用途】1.试剂配制乙型肝炎病毒是乙型病毒性肝炎的病原体，具有较强传染性，传播途径复杂，流行面广，发病率高等特点，可导按样本数（样本数＝待检血清样本数＋血清对照品3个＋定量校准品5个）n配制反应液：致急慢性乙型肝炎，淤胆型肝炎，严重的可导致急性肝衰竭，临床上主要表现为肝功能损害，部分患者可有黄疸。隐形感取PCR缓冲液An×15μl、HBV引物探针n×10μl、Taq酶n×5μ

3、l、MgCl2n×13μl至于一离心管中混匀；低速离染较为常见。心数秒，按43μl/管分装到反应管中。目前临床上常用的HBV检测方法主要有酶免疫法、化学发光法检测HBV标志物和核酸检测HBVDNA方法。本试剂2.内参配制盒定量检测人血清和血浆样本中的乙型肝炎病毒DNA，主要是通过对乙肝患者血中HBVDNA基线水平和变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测。检测结果仅供临床参考，不能作为患者病情单独的评价指标，必须结合临床将n×3μl内参（单通道仪器不加内参）及n×50μl核酸提取液B至于一新离心管中混匀备用（混合后避免反复冻融表现和其他实验室

4、检测指标对患者病情进行评价，亦不能作为血液筛查HBV病毒的筛查试剂使用。使用，使用前混匀5秒钟）。【检验原理】3.样本、对照品的处理本品基于TaqMan探针实时荧光PCR技术。在PCR反应过程中，同时利用Taq酶的5’→3’聚合酶活性和核酸外样本处理：取100μl待检血清样本（冻存血清使用前在室温融解，振荡混匀10秒钟）分别加入100μl核酸提取液A，切酶活性，使得TaqMan探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射，FAM荧光检测乙型肝炎病毒，JOE/RED振荡混匀10秒种，12000rpm离心10分钟，弃上清；分别加入50μl核酸提取液B

5、与内参的混合液至沉淀中（使用前一定610nm波长通道检测内参。要充分混匀，将颗粒和液体一起加入沉淀中，其中颗粒量应在15％以内），振荡混匀10秒钟，100℃保温10分钟，12000rpm本品使用外源性内参，可以监控和避免由于样本中的PCR抑制物或操作不当引起的“假阴性”结果。【主要组成成份】离心2分钟。处理后的样品应在1小时内使用，或在-20℃～-80℃最长保存1个月（不宜反复冻融）。每个反应组份名称装量主要成份血清对照品处理：按照血清标本处理方法处理试剂盒内阳性血清对照、弱阳性血清对照、阴性对照。（冻存血清对照品中的用量使用前在室温融解，振荡混匀10秒

6、钟）。1核酸提取液A3×1.1ml/管100μl聚乙二醇、NaCl定量校准品处理：定量校准品无需处理，在样本加样前直接将定量校准品1号至5号振荡混匀10秒钟，低速离心数秒NaOH、SDS、Tween-20、2核酸提取液B2×1ml/管50μlChelex-100后加样。3内参160μl/管3μl合成病毒4.样本加样4MgCl2450μl/管13μlMgCl2将样品处理上清液（冻存样品使用前室温充分融化，振荡混匀数秒，12,000rpm离心2分钟）、阳性血清对照、弱阳性血清对照、阴性对照以及定量校准品各7μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置定量PCR仪

7、上。5PCR缓冲液A480μl/管15μlBuffer、dNTPs5.仪器扩增程序6Taq酶160μl/管5μlTaq酶、UNG酶1、ABI7300/7500/Mx3000P/SLAN双通道仪器：反应管先在50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按94℃10秒→60℃45HBV引物和探针，内参7HBV引物探针320μl/管10μl引物和探针秒循环40次。60℃采集FAM、JOE荧光通道的信号。8阴性对照100μl/管－HBV阴性血清2、LightCycler480仪器：反应管先在50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按94℃10秒→60℃45秒循环4

8、0次。9阳性血清对照100μl/管－HBV阳性血清60℃采集FAM