《乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒( 型)核酸检测试剂盒(pcr-荧光法)操作规程》

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1、《乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(1+2型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)操作规程》苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实施时间：2012年04月01日乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）操作规程1.目的规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。2.原理2.1汇集：吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。试剂盒提供之内对照(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。标本经裂解液

2、处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。2.3扩增：采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）进行检测。在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDN

3、A聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实施时间：2012年04月01日选择性PCR扩增：采用UNG-dUTP抗污染系统。在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。2.4质量

4、控制原理为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。2.4.2低浓度阳性质控品监控系统假阴性，如果低浓度阳性质控品检测结果为阴性，说明实验存在假阴性或灵敏度下降的风险，因此实验中的阴性结果均需复测。2.4.3内对照分为DNA内对照和RNA内对照，是每个反应管中的阳性质控，用于监控单个反应管中DNA与RNA的假阴性风险，如果标本检测结果为阴性，其DNA内对照与RNA内对照结果必须为阳性，否则提示该标本

5、的扩增受到抑制，该阴性检测结果有假阴性风险，需要复测。3.适用范围适用于核酸实验室采用核酸技术进行的HBV、HCV、HIV三项单管混样检测。4.职责4.1授权的检验人员负责试验操作、结果判读，作好相关记录，对检测结果的真实性和有效性负责。4.2授权的监督人员负责监督该规程执行。5.原始样品系统血浆6.材料与设备6.1消耗品6.1.1乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法），苏州华益美生物科技有限公司；6.1.296孔深孔板6.1.31.5ml离心管（手工实验用）和2mlAxgen离心管（用于配置PCR反应液）；6.

6、1.45ml汇集管；6.1.596孔扩增板或八连管；6.1.6带滤芯并经灭菌处理的Tip头；6.1.7自封袋；6.1.8磁棒套管；6.1.9留样板和封膜苏州华益美核酸实验室文件编号：HYM/C-525-JY版本号：1/A实施时间：2012年04月01日6.2.1HAMILTONSTAR全自动样品处理系统；6.2.2MeDiProSuperPureSystem-32核酸萃取仪；6.2.3ABI7500荧光定量PCR仪；7.检测环境7.1符合二级生物安全实验室条件。工作环境要求空气流通、照明充足；室内环境整洁、干净并配有消毒设备。7.2实验室温度：20-30℃；湿度

7、40-60%。8.程序步骤8.1试剂准备区操作8.1.1消耗品的准备和深孔板反应盘的预分装8.1.1.1常规实验清点当日试验所需的消耗品，移送标本制备区，并做好记录。8.1.1.2手工实验8.1.1.2.1预分装洗涤液A、洗涤液B、洗脱液，需充分混匀，使用移液器分配至反应盘L-28.1.1.2.2可于前一工作日预分装4.2ml核酸萃取液到5ml管；8.1.2反应液的配制8.1.2.1常规操作8.1.2.1.1从-20℃冰箱取出试剂的反应液A、反应液B、反转录酶、RNA保护剂、Taq酶；室温溶解、平衡（反应液的配制时间应控制在15—20分钟，则平衡时间大约10分钟

8、），于震荡器上充分混匀。