金葡菌表型实验.docx

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1、2.2.5金黄色葡萄球菌的相关表型实验方法2.2.5.1生长曲线的测定（1）从37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，接种至含有1mlTSB的10ml培养管中。于37℃振荡培养（转速220RPM）过夜。（2）1:100将菌转接入含有50mlTSB，MH或PN培养基的250ml烧瓶中，37℃震荡培养（转速220RPM）。（3）每小时测量各瓶OD600数值，至细菌进入稳定期数值基本不再改变（约12小时）。2.2.5.2自溶实验（1）从37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至TSB培养基中，于37℃振荡培养至指数中期。

2、（2）离心10min，回收细胞。（3）用PBS洗细胞，重复三次。（4）将细胞重悬于等量含有0.05%（W/V）TritonX-100的Tris-HCl（pH7.5）缓冲液中。（5）将细胞重悬液于30℃振荡培养（转速220RPM）。（6）从测量零时开始，每隔30min测量OD600的值，直到OD值降到初始值的一半以下。2.2.5.3生物膜实验（1）从37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有1mlTSB的10ml培养管中。于37℃振荡培养（转速220RPM）过夜。（2）将过夜培养的金葡菌按照1:100的接种量接种至新鲜TSB

3、培养基，混匀。（3）将混合接种物分装至96孔板（Costar3599），每孔200ml或者24孔板（Costar3524），每孔1000ml。在37℃恒温箱静置培养。（4）培养一定时间后，取出孔板，弃掉上清，并用水轻柔地洗孔板三次。（5）每孔加入100ml（96孔板）或500ml（24孔板）结晶紫染色液，常温下静置15min染色。（6）弃掉结晶紫染色液，用水轻柔地洗孔板三次，吹干。（7）拍照，用酶标仪检测OD560度数。2.2.5.4alpha溶血素检测（1）从37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有1mlTSB的10m

4、l培养管中。于37℃振荡培养（转速220RPM）过夜。（2）测量OD600并将不同的菌株调整至OD600一致。（3）在羊血平板上分别滴上1ml金葡菌培养物，在37℃恒温箱静置培养24小时。（4）观察菌落周围血细胞被溶解后形成的透明环，拍照。2.2.5.5胞外蛋白酶实验（1）从37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有1mlTSB的10ml培养管中。于37℃振荡培养（转速220RPM）过夜。（2）测量OD600并将不同的菌株调整至OD600一致。（3）在牛奶平板上分别滴上1ml金葡菌培养物，在37℃恒温箱静置培养24小时。（

5、4）观察菌落周围牛奶蛋白被溶解后形成的透明环，拍照。2.2.5.6万古霉素敏感性实验平板试验：（1）从37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有1mlTSB的10ml培养管中。于37℃振荡培养（转速220RPM）过夜。（2）测量OD600并调整至CFU约107个/ml（约OD600=0.05）。（3）1:10梯度稀释，并分别涂布置含有不同浓度万古霉素的MH平板。（4）37℃恒温箱静置培养24小时。（5）观察并计数。液体实验：（1）从37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有1mlTSB的10ml培养管中。于

6、37℃振荡培养（转速220RPM）过夜。（2）测量OD600并调整接种至10mlMH培养基，CFU约107个/ml。（3）每小时测量各瓶OD600数值，至细菌进入稳定期数值基本不再改变（约12小时）。2.2.5.7葡萄糖-6-磷酸诱导实验（1）从37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有1mlTSB的10ml培养管中。于37℃振荡培养（转速220RPM）过夜。（2）离心收集，用无菌PBS清洗三次，调整至OD600=1.0。（3）1:100接种至PN培养基，37℃振荡培养（转速220RPM）6小时。（4）向培养物中添加葡萄糖

7、-6-磷酸至终浓度5g/L，继续培养。（5）在不同时间点分别收集1ml菌液（添加前0min，添加后1min，5min，30min），抽提RNA。2.2.5.8金黄色葡萄球菌上清AI-2浓度检测（1）收集菌液上清。将1:100接种的金葡菌每隔固定时间测量OD600的值并取200ml菌液，4℃离心取上清，保存至-80℃待用。（2）将上清化冻后，分别加样至专用发光检测96孔板，每孔20ml。（3）将过夜培养的弧菌BB170根据发光强度1:5000到1:10000稀释，分装至发光检测板，每孔180ml。（4）在30℃振荡培养，定时使用Verita

8、s发光检测仪检测发光强度。（5）对照组发光强度-时间曲线会出现“V”型曲线，取曲线最低点附近，测量组与对照组发光强度的比值，即可表征AI-2浓度