实验6-大肠杆菌感受态细胞的制备与转化课件.ppt

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1、实验六大肠杆菌感受态细胞的制备和转化基因工程的基本路线PCR质粒DNA提取和酶切连接转化操作步骤（一）受体菌的培养1、－70℃或－20℃低温冰箱取出菌种后，在LB培养液中培养过夜，进行活化;2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于37℃培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其

2、接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）（二）、感受态细胞的制备(CaCl2法)1、将1.5ml菌液移入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下5000rpm离心5分钟。2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余的过多水分）。3、加入1ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻拨动管底使细胞完全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下5000rpm离心5分钟。3、弃去上清,加入0.2ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞，即制成感受态细胞。将感受态细胞悬液分装成2份(1.5ml管)，每份100μl（注意悬液密度要均匀）。冰上放置备用。4、暂时不用的感受

3、态细胞可置于-80℃保存。注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！（三）质粒pUC19的转化（两人一组，1人做质粒转化，1人做对照）质粒和感受态细胞混和：分别在100μl感受态细胞悬液中加入下列DNA质粒或水，轻轻摇匀后冰上放置30分钟。感受态细胞+pUC19质粒2μl(10ng/ul,含量不超过50ng,体积不超过10μl)感受态细胞+无菌水2μl（阴性对照）热击：42℃水浴中热击90秒（注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。复苏：向每管中加入400μlLB液体培养基(注：不含Amp),混匀后37℃轻摇培养1~1.5小时,使细菌恢

4、复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。实验目的掌握氯化钙法制备与转化感受态细胞的原理、方法和技术。学会对质粒转化结果的评估。实验原理转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞(Compenentcells)。0.1mol/LCaCl2是一种

5、低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击下，细胞可吸收外源DNA。摄入了外援DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基因。带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。Ampr：抗氨苄青霉素–β内酰胺酶:一类具有不同底物专一性、催化水解β内酰胺的酶多克隆位点：外源DNA片段的插入位点Amps菌株Ampr涂布于含Amp的培养基上，可以生长。次日可见白色菌落--转化子。培养基上含有X-Gal和IPTG时，可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子。蓝白斑筛选的原理（α

6、-互补）pUC19载体带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶（β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。蓝白斑筛选的原理（α-互补）现在使用的许多载体都带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（

7、MCS），它并不破坏读框；宿主细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶（β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白