拟南芥的种植.doc

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1、一、拟南芥播种   种子装入dorf管内，20μl种子加1ml75%乙醇消毒1分钟；   吸去乙醇，加入1ml50%次氯酸钠：50%无菌水：0.05%吐温（or5%漂白粉），震荡洗涤15-20分钟；   稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠或漂白粉，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；   将种子用接种环均匀铺于MS培养基上，用封口膜封口，放入4℃冰箱内冷处理2-3天（春化）。   MS培养基的用量：直径为9cm的培养皿用25ml，直径为6cm的培养皿用12.5ml。二、MS固体培养基制备1．培养基母液的配制和保存    MS培养基

2、含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50mL)或1/200(5mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。大量元素(母液Ⅰ，20×)   mg／L     NH4NO3                     33000     KNO3                       38000     CaCl2·2H2O             

3、8800     MgSO4·7H2O            7400     KH2PO4                      3400     微量元素(母液Ⅱ，200×)  mg／L     KI                      166     H3BO3                       1240     MnSO4·4H2O              4460     ZnSO4·7H2O              1720     Na2MoO4·2H2O             50     CuSO4·5H2O 

4、               5     CoCl2·6H2O                5     铁盐(母液Ⅲ，200×)   mg／L     FeSO4·7H2O             5560     Na2-EDTA·2H2O          7460    有机成分(母液Ⅳ，200×)  mg／L ⅣA     肌醇                   20000 ⅣB     烟酸                      100     盐酸吡哆醇(维生素B6)       100     盐酸硫胺素(维生素B1)       

5、100     甘氨酸                    400   上述几种母液都要单独配成1L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L。   母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1L，保存在棕色玻璃瓶中。 2．配制培养液    用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50mL，母液Ⅱ、Ⅲ

6、、ⅣA和ⅣB各5mL。3．溶化琼脂 4．调pH    用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8，因高温灭菌时pH会下降，所以灭菌前通常pH配成6.2左右)。5.培养基的分装 6．高压灭菌 三、拟南芥的种植1．人工土配制   18份蛭石，6份黑土和1份珍珠岩混合均匀，分装于塑料灭菌袋内，扎好口，于98kPa、121.3℃下，灭菌40min。冷却后备用。   有时也用两种土，即上层用不含黑土的

7、人工土，下层用上面所讲的土。我估计原因可能有二：一是黑土容易生霉；二是黑土较难完全粉碎，较大的块状土不便于移栽。2．PNS营养液：每升含   5ml1MKNO3，   2ml1MCa(NO3)2˙4H2O，   2ml1MMgSO4˙7H2O，   2.5ml20mM  Fe.EDTA，   2.5ml1M磷酸缓冲液（pH5.5），   1ml 微量元素。注意：营养液用煮沸冷却后的凉开水配置。PNS营养液母液配方：   ①1M    KNO3  101.1g   ②1M    Ca(NO3)2˙4H2O    236.15g   ③1M    MgSO4

8、˙7H2O，246.48g   ④20mM  Fe.EDTA：