毕业论文-拟南芥突变体的鉴定.doc

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1、拟南芥突变体的鉴定摘要在真核细胞的细胞核中，基因组DNA缠绕在组蛋白上，形成核小体的结构。核心组蛋白的末端会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP-核糖基化等。这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用。组蛋白的甲基化发生在赖氨酸和精氨酸位点，这些位点的甲基化参与异染色质形成，X染色体失活和基因转录的激活与沉默等许多重要的生物学功能。早先认为组蛋白上的甲基化是不可逆的。然而近年来在哺乳动物和酵母中相继发现了许多组蛋白去甲基化酶。其中最大的一个基因家族是包含有JMJC结构域的组蛋白去甲基化酶家族。在植物中还没有报道有组

2、蛋白去甲基化酶。我们通过基因组注释以及序列比对从拟南芥中鉴定出21个编码包含有JMJC结构域蛋白的基因。并从SALK突变体库中筛选鉴定了相应的T-DNA插入突变体。利用分子标记，我们筛选出了37个纯合T-DNA插入株系。给我们以后分析这些基因在植物生长发育中所起的作用打下了坚实的基础。关键词组蛋白密码，甲基化，去甲基化，T-DNA插入突变体1背景介绍1.1“组蛋白密码”理论与表观遗传学在真核细胞的细胞核小，基因组D"与组蛋口和非组蛋口相互结合，构成遗传信息的物质载体——染色质。染色质山其基木单位核小体重复连接而成，每个核小体包含一个组蛋白八聚体(H2A/H2B-1I3/H4-H3/

3、H4-H2A/H2B)和围绕其上的两圈超螺旋DNA(146KB),核小体Z间通过不同长度的超螺旋DN八和H1组蛋口前•后相接。组蛋口八聚体的成员作为核小体的基木组成元件，在所冇真核生物中高度保守。尽管核心组蛋白均具冇一个三螺旋的结构严整的组蛋白折叠区，其两个末端却没何形成固定结构。然而，这些末端却会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP—核糖基化等。这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方而起着重要的作用⑴2>o针对在组蛋白中存在的广泛修饰作用，Allis及其同事在2000年提出“组蛋白密码”假说⑴。该假说认为：组蛋白尾部的各种修

4、饰是具有位点特弄性的；已有修饰町影响后继修饰；各种修饰的综合，作为“密码”被其它蛋口或蛋白复合体所识别，通过调节RNA聚合酶H及其它转录相关蛋白分子接近DNA模板，引起不同的下游反应，彩响着染色质的不同功能,例如基因表达，DA复制和染色体分离。揭示组蛋白修饰的本质及作用机制対于阐明真核细胞复杂的:基因表达调控具有非常重要的指导意义。1.2组蛋白甲基化组蛋片甲基化是纟F1蛋白上各种修饰屮最复杂的一种。组蛋白上的甲基化已知可以发生在精氨酸和赖氨酸的氨基上。在纽蛋口上有多个位点的精氨酸和赖氨酸上町以发牛甲基化。如组蛋白H3上的第4,9,36和79位赖氨酸,笫2,17,26位的精氨酸。组

5、蛋白H4上的第3位精氨酸，第二十位的赖氨酸。而且粕氨酸甲基转移酶可以催化加上-•个或两个甲基。赖氨酸甲基转移酶则对以在赖氨酸上加上一到三个甲基⑶O这些不同的组合使得组蛋白的甲基化有能力调控多种与染色质相关的生物学功能。比如组蛋白第9位的赖氨酸上的甲棊化在开染色质的形成，X染色体的失活，转录抑制以及指导DNA的卩基化上起着重要的作川。又如组蛋切14第二十位赖氨酸的甲基化参与染色质凝集，异染色质形成，转录抑制，DNA损伤修复以及细胞周期等牛物V过程。相反组蛋口H3第4位，第36位，第79位赖氨酸的甲基化则被认为与基因的转录激活正相关"5>«在植物中组蛋白甲基化酶在基因沉默和植物的发育中

6、起着重要的作用。如KYP/SUVH4是DNA上一些CNG和不对称的C上的甲基化所必需的<6）,ATX1是花器官正常分化所必需的（7>,EFS/SDG8则是抑制植物过早开花所必需的⑵9>o1.3组蛋白去甲基化甲基通过稳泄的碳氮键与氨基共价相连。而且早先对组蛋口上的甲基的修饰半衰期的研究认为屮基的半衰期与组蛋白的半衰期相近。因此很久以来组蛋白的「卩基化被认为是不可逆的呦o最近的研究发现。单屮基化的精氨酸可以被PADI4/PAD4脱去氨屮基从而形成瓜氨酸,这是最早的报道能脱去甲基化的纽•蛋门上的甲基的酶。然而PADI4/PAD4不能对双甲基化的精氨酸起作丿IJ，而且脱去甲基的产物并不是原

7、來的精氨酸而成了瓜氨酸，所以该酶仍然不是真正的去甲基化12>oESDI的发现打开了对组蛋白去甲基化研究的大门。LSD1可以通过氧化反映去处组蛋白H3第4位和笫9位单或双甲基化的赖氨酸上的甲基3⑷。然而LSD1只是很小的一个基因家族，与已知的甲基转移酶的数最相比是很少的。同时YiZhang实验室通过生物化学手段跟踪去甲基化酶的活性发现了含冇JHJC结构域的组蛋白去卬棊化酶，并R证明是JMJC结构域是去甲基化的催化屮心，随示对JMJC结构域的晶体结构的研究使人们确信了这一