拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

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1、遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsisthaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。Ø植株形态个体小，高度只有30cm左右；Ø生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；Ø种子多，每株可产生数千粒种子；Ø形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；Ø遗传转化简单，转化效率高；Ø基因组小，只

2、有5对染色体，125MB；Ø在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferredDNA），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植

3、物基因组。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图1结果鉴定图2PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaqbuff

4、er，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。四、实验步骤1、植物DNA提取方法（CTAB法）1)水浴加热CTAB提取液至65℃；2)取叶片100mg,液氮研磨成粉末；3)加入600µlCTAB提取液并混匀；4)65℃水浴45min（至少30min）；5)12,000rpm离心10min；6)将上清转移到新离心管，加入等体积氯仿/异戊醇,混匀；7)12,000rpm离心5-10min,将上清液转移到新管中；8)向上清中加入1/10体积3MNaAc,再加入预冷的等体积异丙醇或2V无水乙醇,混匀冰上放置10min；9)12,000rp

5、m离心10min，弃上清，加入500µl70％乙醇洗涤2min；10)12,000rpm离心5min，弃上清，吸干残留并干燥；11)加20-50µlTE缓冲液溶解DNA。2、PCR反应1)引物设计ØLP:5’-TCATCCACCATGGAAGAAAAGØRP:5’-TTGGATACGATGCGAGTAAACØBP:5’-TTGTTCACGTAGTGGGCCATCGØLP+RP:1107bpØBP+RP:560-860bp2）PCR反应体系ØH2O:12.4μlØ10×Buffer:2μlØdNTP:0.5μlØMgCl2:2μlØLP

6、/BP:0.5μlØRP:0.5μlØTaq:0.1μlØDNA:2μlØTotal:20μl3)PCR温度设定Ø94℃5minØ33cyclen变性：94℃30sn退火：53℃30sn延伸：72℃1min30sØ72℃7min3、琼脂糖凝胶电泳分析1)500-1000bp：1.2%，Agarose0.5×TBE；2)化胶时应注意不能沸出，冷却至约60℃制胶，凝胶充分冷却凝固后点样进行电泳；3)PCR产物加3-4μl6×loadingbuffer；4)120V稳压电泳；5)EB染色10min，紫外观察。五、结果分析PCR产物电泳截图结

7、果如下图所示。12345678910111213图3PCR产物电泳条带图在图3，第7泳道为DL2000DNAmarker，第5泳道是BP-RP引物体系，第六泳道是LP-RP引物体系。BP-RP体系的PCR产物产生一条略大于750bp的DNA条带，而LP-RP引物体系中没有在大致900bp的位置产生条带。由此，可以断定此样品为纯和突变体。六、思考与讨论1、加液氮碾磨叶片时，最好保持离心管中始终有液体氮存在，如果碾磨一段时间后中途要加液氮继续碾磨，一定注意，液氮沸腾时极易将已经碾磨好的叶片吹走；另一点，碾磨时要迅速，避免空气中的水汽在离心

8、管上凝结。本次试验中，离心管出现了冰霜，可能对最后的结果有影响。2、DNA有一定的物理脆性，所以在提取过程中混匀时一定要缓慢的摇晃，切忌剧烈震荡。3、加液氮碾磨时，注意不要将叶片挤到离心管的底部，那样会导致碾磨不充分。遇