拟南芥原生质体的制备及转化.doc

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1、拟南芥原生质体制备转化操作流程主要试剂1.纤维素酶解液：试剂15ml酶液体系1．1-1.5﹪CellulaseR10(YaKultHonsha)0.225g干粉2．0.2-0.4﹪MecerozymeR10(YaKultHonsha)0.045g干粉3．0.4Mmannitol1.09g干粉4．20mMKCl1ml0.3MKCl母液5．20mMMES,pH5.7，1ml0.3MMES,pH5.7母液6．加入10ml水7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mMCaCl，1ml0.15MCaCl29．5mMβ-Mercapt

2、oethanol（可选用）1ml75mMβ-Mercaptoethanol母液(SigmaA-6793)10．0.1﹪BSA，1ml1.5﹪BSA（4℃保存）11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。2.PEG溶液（40%,v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ulPEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）PEG4000(Fluka,#81240)……………1g………………………………….4g水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g0.8MMannitol……………………

3、……..0.625ml…………………………2.5ml1MCaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml约1.2ml3.W5溶液（1000ml）154mMNaCl,NaCl9g125mMCaCl2,CaCl2.H2O18.4g5mMKCl,KCl0.37g2mMMES（PH5.7），MES0.39gpHto5.8withKOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。4.MMG溶液MaMg溶液（500ml）15mMMgCl2，MgCl0.71g4mMMES(PH5.7)MES0.39g0.4Mmannitol，Mannitol36.5g用K

4、OH调pH5.7，高温高压灭菌20分钟，室温保存。5.WI溶液WI(200ml)0.5Mmannitol，mannitol18.217g4mMMES,pH5.7，MES0.156g20mMKCl，KCl0.12g高温高压灭菌，室温保存。实验步骤1.土培室播种种植拟南芥。2.生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。3.剪取中部生长良好的叶片用新的剃须刀片切成0.5-1mm宽的叶条。4.将切好叶条掷入预先配置好的酶解液（10ml的酶液用125ml的三角瓶装）中（每5-10ml酶解液大约需10-20片叶子（小量））(100-150叶片需要40-60ml酶解液（大量

5、）)。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。5.用真空泵于黑暗中抽5-30分钟。6.或者将叶条至于培养皿中加入酶液放入真空干燥箱里，在黑暗中消化3个小时，此步需要根据你自己的实验经验，通常会延长孵育16-18h。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000ul枪头去尖使操作时吸打缓和。）（此时预冷一定量W5溶液）7.显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50um。8.在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。9.先用W5溶液润湿35-75um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。10.用30毫升的

6、圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体，如果回收率低可以提高转速或是加入CaCl2（50mM）。尽量去除上清然后用10ml冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体(电转化用预冷的W1)终浓度为1-2x105/ml。11.在冰上静至原生质体30分钟。(在有些实验中原生质体在使用前可以在室温终保存)以下操作在室温23℃下进行12.100g离心1-3分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。13.加入10ulDNA（10-20微克约5kb的质粒DNA）至2ml离心管中

7、。14.加入100ul原生质体（2x104个），轻柔混合。15.加入110ulPEG/Ca溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。16.诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。17.室温下用440ulW5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。18.室温下用台式离心机100g离心1-3分钟然后去除上清，将原生质体轻轻吹打稀释至100ul。再加入1mlW5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。19.用1mlWI或者W5溶液轻柔重悬原生质体于六孔组