原生质体制备方法.doc

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1、原生质体制备方法培养基：①PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水②MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、PH6.5③MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、0.5mol蔗糖、1L水、PH6.5④MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、0.5mol蔗糖、PH6.5试剂：①1mol/LMgSO4②0.5mol/LMgSO4③STC：0.8M山梨醇、50mMTris-Hcl（PH8.0）、50mMCaCl2④肝素⑤SPTC：0.8M山梨醇、40%PEG、5

2、0mMTris-Hcl（PH8.0）、50mMCaCl2⑥无菌水操作步骤：①倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days②用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG液体培养基中，120rmp，28℃，12h③以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h④混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤下来，用无菌水和1mol/LMgSO4各冲洗三次，菌丝发白即可，冰上备用⑤酶解体系的配制：取Dryslase45mg+Yartlase105

3、mg至无菌量管中，用10ml1mol/LMgSO4溶解彻底，用无菌滤头和针筒过滤除菌，滤液保存于冰上⑥1g菌丝加入到10ml酶解体系中，于无菌三角瓶中进行酶解反应，30℃，60rpm，3h⑦用带有无菌滤布的漏斗过滤酶解液，滤液用无菌50ml大管收集，用20ml0.5mol/LMgSO4冲洗三角瓶和漏斗，3500rpm，10min，取上清⑧沉淀用20mlSTC溶解悬浮，3500rpm，10min，取上清⑨沉淀下来的原生质体用800μLSTC溶液悬浮，并加入200μL的SPTC溶液，加入SPTC时一滴一滴加，混匀后镜检计数，大于107可用，冰上备用⑩⑪⑫