蛹虫草菌株原生质体的制备方法试验研究

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1、2014年第5期（总第180期）蛹虫草菌株原生质体的制备方法试验研究胡秀彩12，吕爱军（1.江苏省药用植物生物技术重点实验室;2.江苏师范大学生命科学学院（泉山校区），江苏徐州上海路101号221116）摘要：蛹虫草具有与冬虫夏草极相似的药理作用，可作为冬虫夏草代替品。本试验以蛹虫草菌株CM-1为出发菌株，结果表明蛹虫草菌原生质体制备的快速简便方法为:菌体液体培养96h，用0.6mol/L甘露醇溶液作为渗透压稳定剂，取1g菌丝体以1:20比例加入复合酶液，在pH6.8、28℃条件下酶解2.5h，获得原

2、生质体数最多，达到5.08×108个/mL；原生质体再生培养基为含0.6mol/L甘露醇PDA培养基，原生质体再生率最高为4.69％。关键词：蛹虫草；原生质体；制备中图分类号：S853.7文献标识码：B文章编号：1003-8655（2014）05-0017-03蛹虫草（Cordycepsmilitaris）又称北冬虫夏纤维素酶购自杭州贝奥生物技术工程有限公司；草，属子囊菌纲，肉座菌目，麦角菌科，虫草属，是本实验所用其他试剂均为分析纯。我国名贵的中药材之一，具有抗疲劳、抗增生、抑1.2方法制肿瘤、降血糖

3、、降血脂等多种药理作用[1]。在功1.2.1培养基与溶液的配制PDA固体斜面培能食品、医药和生物学技术方面具有很好的价养基：去皮马铃薯200g(加水煮烂，过滤得上清值，市场需求量与日俱增，具有极大的研究开发液)、蛋白胨0.2%、酵母浸膏0.1%、葡萄糖2%、琼17空间。但在实际生产实践中，由于很难深入研究脂1.5%、蒸馏水定容至1000mL，pH值自然，用于试蛹虫草有性发育的规律，以致菌种不稳定、易退菌种保存及复苏。验化仍是限制蛹虫草资源深度开发和利用的主要液体摇瓶培养基：葡萄糖2%、黄豆粉2.5%、

4、研瓶颈之一。原生质体及其融合技术是近些年来迅蛋白胨0.2%、牛肉膏0.1%、K2HPO40.15%、VB1究速发展起来的生物工程育种新技术[2，3]。迄今，国与VB2各5mg、蒸馏水定容至1000mL，pH值自内外学者已从香菇、木耳、灵芝等50多种食用菌然。中成功制备原生质体，并结合分子生物学技术进再生固体培养基：去皮马铃薯200g、葡萄糖行了大量的研究，取得了令人瞩目的进展[4-6]。关2%、蛋白胨0.2%、琼脂1.5%、牛肉膏0.1%、于研究蛹虫草的原生质体的制备与再生条件的K2HPO40.15%

5、、VB1与VB2各5mg、0.6mol/L的甘报道较少，并且步骤繁琐，不适应大批量生产实露醇、蒸馏水定容至1000mL，pH值自然。践[1，3]。因此本试验对蛹虫草原生质体的形成、再0.6mol/L甘露醇稳定剂：称取54.6g甘露醇，简化，为适应蛹虫草在大批量生产提供科学参用无菌水定容于500mL容量瓶中，配制成考。0.6mol/L的甘露醇稳定剂[7，8]，经121℃高压灭菌1材料与方法20min备用；20g/L蜗牛酶液：称取0.2g蜗牛酶，溶1.1材料供试菌种蛹虫草（Cordycepsmilitar

6、i）于10mL0.6mol/L的甘露醇稳定剂中，待完全溶菌株CM-1江苏省药用植物生物技术重点实验解，经0.45μm微孔滤膜过滤除菌备用；10g/L纤室提供，马铃薯、黄豆粉购自徐州某市场。溶壁维素酶：称取0.1g纤维素酶，溶于10mL0.6mol/L酶、蜗牛酶购自北京北纳创联生物技术研究院；的甘露醇稳定剂，待完全溶解，经0.45μm微孔滤收稿日期：2014-06-13膜过滤除菌备用。复合酶液：将上述配置好的两基金项目：江苏师范大学科研基金重点项目（11XLA20），国种酶液按照1:2的体积比混合，经0

7、.45μm微孔家自然科学基金（31272692、30800847）。滤膜过滤除菌备用。通讯作者：吕爱军（1973-），内蒙古锡盟人，副教授，博士，主要从事微生物及免疫学研究，E-mail：lajand@126.com1.2.2蛹虫草菌株CM-1的活化及培养用接种2014年第5期（总第180期）针无菌操作挑取保藏菌种，接种于斜面培养基高带动其再生率最高，因此我们在后续的工作中上，28℃培养箱内活化1次，培养144h；接种活化选择最佳菌龄培养时间为96h。后的菌块于250mL的摇瓶中加入150mL液体培2

8、.2酶解时间对菌株CM-1原生质体产量及其养基，置于转速150r/min，28℃摇床扩大培养再生率的影响取活化后的蛹虫草菌株CM-1菌24～144h。块接种于液体培养基中，28℃、150r/min摇瓶培养1.2.3原生质体的制备将已培养72h的菌丝96h，酶解时间分别为1、1.5、2、2.5、3、3.5h，计算体置于离心管中，以3000r/min的速度离心原生质体产量分别为1.24×108、2.78×108、10min，去除上清液，用0.6mol/L的甘