农杆菌介导法课件.ppt

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1、农杆菌介导转化法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。农杆菌感染柳树产生冠瘿瘤原理：根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农

2、杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。Story冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面的根茎交界处，形似帽状而得名。1907年，Smith&Townsent农杆菌诱发冠瘿瘤病。1947年，Braunetal.证实俩者的关系，但发现有的菌株不致病。提出了假说：tumour-inducingprinciple,TIP.肿瘤诱导因子。60’s,肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine,nopaline）总称冠瘿碱（opin

3、e)。Petitetal.证实肿瘤组织合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了TIP)1974年，Zaenenetal,Schell,VanLarebekeetal.从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒(tumorinducingplasmid)，称为Ti质粒。Ti=TIP1977年，Chiltonetal.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存在外源的DNA,与Ti质粒的DNA有同源性，是整合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段，T-DNA(transferred

4、DNA),其内有致瘤和冠瘿碱合成酶等基因。1981年，Oomsetal.发现Ti质粒上有致瘤区(virulenceregion)，Vir区。Ti质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子，长度约200kb，平均周长54.1－75.4um，分子质量为（90－150）×106Da。在温度低与30℃的条件下，Ti质粒可稳定地存在于根癌农杆菌细胞内。Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外，还具有以下几种重要功能：1、赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力；2、赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力

5、；3、根癌农杆菌的寄主植物范围；4、决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分；5、参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素的代谢活。1)Ti质粒的结构来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类胭脂碱(nopaline)类农杆碱（agropine）类。Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达，它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、

6、氮源和碳源。长度：160-250kb6大功能区：1)致瘤区，这个区主要合成植物生长素和细胞分裂素；2)冠瘿碱合成区；3)冠瘿碱分解区；4)Ti质粒接合转移区(tra)；5)毒性区（Vir）；6)DNA复制区（Rep）。在致瘤区、冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24bp直接重复序列，由这三部分所构成的DNA区域叫做T-DNA。致瘤区+冠瘿碱+左右边界=T-DNA插入植物染色体中的Ti质粒片段只有T-DNA。T-DNA区域中的这些基因只有在T-DNA插入到植物基因组后才能激活表达.T-DNAT-DNA：Tms1

7、、Tms2、Tmr这3个基因表达植物生长素和细胞分裂素,可调节植物细胞的生长和发育,它们的过量表达刺激植物细胞大量快速增长而形成冠瘿。冠瘿碱合成基因在宿主植物体内合并分泌出来,被Ti质粒上的冠瘿碱代谢基因分解成碳源和氮源，供根癌农杆菌生长所须。脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp的重复序列,构成T-DNA的左边界和右边界。在某些章鱼碱型根癌农根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA是以两个分开的独立片段形式存在，即T-DNA左边区段和T-DNA右边区段。插入在T-DNA边界序列之间的任何D

8、NA都可被转到植物染色体中。因此Ti质粒可用做外源目的基因的载体。Vir区（Vir-region）：即毒性区。其长度约为35kb。控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞有关部位，与感染后冠瘿形成有关。Vir区位于T-DNA区左侧，包含义个毒性遗传点（virA、virＢ、virC、virＤ、virＥ和virG）。vir基因控制着Ｔ－ＤＮＡ的转移。virＥvirＤvirCvirGvirＢvirA植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高