农杆菌介导的水稻转化

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1、农杆菌介导的水稻转化实验目的学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。实验原理随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。DNA直接导入法主要包括PEG（polyethyleneglycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG

2、法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整

3、性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。所以已成为转化单子叶植物的首选方法。一、目标基因对农杆菌的转化1.1农杆菌感受态细胞的制备1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线，28℃黑暗培养。2.挑取单菌落接种于5mlYM液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12-16小时。3.取2ml菌液转接于100mlYM液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.5。4.转入无菌离心管，5000rpm离心5分钟,去上清液。

4、5.加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20分钟后，4℃，5000rpm离心5分钟，去上清。6.加入4ml预冷的含10%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。7.农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。1.2.双元载体转化农杆菌EHA105取1μg左右的质粒DNA加入到200mlEHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30分钟，-70℃放置3分钟，42℃水浴1-2分钟，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培2-3小时后涂在含50μg/mlKanamycin的YM平板上，28℃培养。

5、1.3农杆菌转化子的PCR鉴定将农杆菌转化子，用PCR方法鉴定是否正确转进EHA105中。挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/mlKanamycin的YM液体培养基中，28℃，220rpm摇培16小时，直接用菌液做PCR。PCR所用的引物为pCAMBIA1301载体上特异性的引物FP35S：5’-TACGCACAATCCCACTATCCTT-3’，RPGUS：5’-CTGATGCTCCATCACTTCCTGA-3’。PCR反应参数设置：94℃预变性3分钟后开始以下循环反应：94℃变性30秒，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环后72℃继续延伸10分

6、钟，反应结束后，取20μl反应液在1.0%琼脂糖凝胶中电泳扩增产物。PCR反应体系母液浓度体积终浓度农杆菌转化子菌液体2μlP12μM2μl200nMP22μM2μl200nM10×PCRBuffer2μlMg2+25mM1.2μl1.5mMdNTP2.5mM1.2μl150μMTaq酶5U/μl0.2μl1UH2O9.4μl终体积20μl2.根癌农杆菌介导的水稻转化2.1.水稻转化受体的准备2.1.1.水稻幼胚愈伤组织的诱导培养取开花后12-15天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠

7、溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90分钟进行表面灭菌，灭菌时要经常搅拌。用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB培养基）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。2.1.2.水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1%升汞浸泡30分钟，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。

8、约10-15天后，剥下成