农杆菌介导转化法的概述

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1、农杆菌介导转化法的概述自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的牛物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微牛物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。山目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统，外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术0。农杆菌介导法起初只被用于双

2、子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物(尤其是水稻)屮也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。农杆菌卩句是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠樱瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。1.1根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘻瘤；Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合环状DNA分子，大小约200-250kbo依据Ti质粒诱导的槓物细胞产生的冠樱碱的种类

3、不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型(Octopine)、胭脂碱型(Nopaline)＞农杆碱型(Agropine)和琥珀碱型(Succinamopine)。原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区：1.1.1T-DNA区(Treinsfer—DNAregion):不同来源的菌株,T-DNA的长度在12~24kb,它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到槓物基因组中的一段DNA,其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA木身的转移与整合无关.T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25bp的重复序列.其中14bp是完全保守的，分10bp(CAGGA

4、ATATAT)和4bp(GTAA)不连续的2组.左右2个边界(LB和RB)是T—DNA转移所必需的，只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA的右边界在T-DNA的整合屮对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要。1.1.2毒性区(vir区)：位于T-DNA以外的1个30-40kb的区域内，该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中，但对T-DNA的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)o目前，对章鱼碱型农杆菌Ti质粒pTi15955和胭脂碱型农杆菌Ti质粒pTiC58的v

5、ir区进疔了全序列分析，在章鱼碱型Ti质粒的vir区发现了8个操纵子，分别为virA-vjrH,共包括23个基因(virA,virBl-virBll,virCl,virC2,virDl-virD4,virEl,virE2,virF,virG,virH)•而胭脂碱型Ti质粒的vir区不含vjrF和virH操纵子,它含有另一个基因tzs,也有学者认为有大约35个vir基因成簇排布于vir区。1.1.3接合转移区(Con区):该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra),调控Ti质粒在农杆菌间转移。1.1・4复制起始区(ori区)：该区段调控Ti质粒的自我复制。在遗传转化过程

6、中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因•染色体基因包chvA、chvB>att>pscA>chvD以及chvB.它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。1.2发根农杆菌发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)含有Ri质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。其侵染植物是将其Ri质粒上的T-DNA插入到宿主植物基因组屮，这一点与Ti质粒相类似。转移机制也类似，所不同的是vir区和T-DNA区所含基因及其同源性不同。发根农杆菌由于宿主槓物损伤部位产生的酚类化合物而附着在植物的细胞壁上，virA的

7、产物是一种跨膜蛋白，进一步激活virG的产物。T-DMA区的TL区具有较高的稳定性，TR区具有与生长素合成有关的基因tmsl和tms2及农杆碱或甘露碱合成基因。TR区可进行改造，这样Ri通过农杆菌细胞膜特定“孔道”进入宿主植物细胞核，进而使T-DNA整合到植物基因组中。2转化过程农杆菌介导的T-D7A的转移和整合是细菌和植物细胞相互作用发生生物学效应的过程，兼具原核生物中的细菌结合转移及真核细胞加工修饰的特点。其转化过程E咖下:2.1细菌在植物伤口处附着，使受伤的植物组织产生酚类化合物，诱导Ti质粒内vir基因的表