氨基移换反应课件.ppt

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1、氨基移换反应学习纸层析的原理和方法鉴定肝脏组织中的氨基移换反应实验目的实验原理氨基移换反应（转氨基作用）由转氨酶催化，将α-氨基酸的氨基转移到α-酮酸酮基的位置上，生成相应的α-氨基酸，而原来的α-氨基酸则转变为相应的α-酮酸，为可逆反应。R’-CH(NH2)COOHR”-COCOOHR’-COCOOHR”-CH(NH2)COOH实验原理转氨酶以磷酸吡哆醛(胺)为辅酶，最适PH为7.4。转氨基作用可以在各种氨基酸与α-酮酸之间普遍进行。除Gly，Lys，Thr，Pro外，均可参加转氨基作用。谷丙转氨酶（GPT）该酶又称丙氨酸氨基转移酶（ALT），在肝

2、脏中活性较高。在肝脏疾病时，可引起血清中GPT活性明显升高。本实验用纸层析的方法观察丙酮酸和谷氨酸的混合液在肝脏谷丙转氨酶的作用下变成丙氨酸和α-酮戊二酸纸层析以滤纸及其结合水作为固定相，把欲分离的混合氨基酸样品加于滤纸上，使流动相（展开剂）经此移动，各组分就在两相溶剂发生分配现象，由于各种氨基酸的分配系数不同，就逐渐集中于滤纸上不同的部位，而彼此分离；层析完毕后，茚三酮显色，计算各组分的比移值。试剂和材料试剂器材0.1M谷氨酸溶液0.1%KHCO3丙酮酸钠溶液0.1%茚三酮酒精溶液0.5%标准氨基酸溶液：Ala和Glu水饱和酚试管2支微量移液器研钵

3、，滴管水浴锅层析纸，电吹风，毛细管，培养皿实验方法制备肝脏组织的匀浆称取动物肝脏2g，加入6ml生理盐水（0.9%NaCl），加少量细沙，研磨成细浆实验方法酶反应12（对照）肝匀浆20滴20滴（煮沸3分钟）0.1M谷氨酸1ml1ml0.1M丙酮酸钠1ml1ml0.1%KHCO31ml1ml摇匀，45℃水浴中保温60分钟2%醋酸4滴4滴摇匀，沸水浴加热4分钟，冷却后直接用毛细管点样水开后煮5分钟水开后煮4分钟实验方法层析（1）点样取一张滤纸，用铅笔划一个半径为1cm的园，点四个等距离的点，做好记号；用毛细管点样，标准丙氨酸和谷氨酸以及对照组样品点2次，

4、待测样品点2～3次，点子不要超过2mm；（2）展层在滤纸中心开一个小孔，装上纸捻。点样面纸捻朝上，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡5min。将滤纸放入展层剂中展层，展层剂扩散到边缘1cm时，取出滤纸。用铅笔画出展层剂扩散的边缘，电吹风吹干。（3）显色向滤纸上喷茚三酮酒精溶液，热风吹干结果分析画出图谱，计算Rf值由Rf值确定各点的氨基酸组成，并解释实验结果