浙江大学生物化学甲实验课件 实验9 氨基移换反应及其产物的鉴定 (2)

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1、蔗糖酶分离纯化产物的SDS－PAGE检测分析及蛋白质相对分子质量测定实验五丁鸣一、实验目的和要求1、学习SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)的基本原理和操作方法2、蔗糖酶分离纯化产物的SDS－PAGE检测分析3、学习测定蛋白质相对分子质量(Mr)的方法二、实验基本原理1、电泳是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即向着与其电荷相反的电极移动的现象。2、电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所产生的电泳迁移率的差别。3、区带电泳：是样品物质在一惰性支持物上进行电泳,因电泳后，样品不同组分形成带状区间，故称区带电泳。4、聚丙

2、烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,简称PAG)是由丙烯酰胺（Acr)和交联试剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在有引发剂（如过硫酸铵或核黄素）和增速剂（如N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，TEMED）的情况下聚合而成的。丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶三维结构5、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，这主要是由蛋白质样品所带的电荷和分子质量的差异性进行分离；在电泳过程中仍保持蛋白质的天然构象、亚基之间的相互作用及其生物活性。6、聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为：⑴连续系统凝胶缓冲液的pH值及凝胶浓度不变。该电泳系统具

3、有电荷效应、分子筛效应；⑵不连续系统凝胶缓冲离子成分、pH值、凝胶浓度、电位梯度不连续，由浓缩胶和分离胶组成。由于浓缩胶的堆积（浓缩）作用，可使样品（即使是稀释样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。该电泳系统具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。7、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以PAG为支持物的电泳，由于各种蛋白质所带静电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。为消除静电荷对迁移率的影响，在整个电泳体系中加入一定量的阴离子去污剂“十二烷基硫酸钠（简称SDS）”和“强还原剂（巯基乙醇）”后，蛋白质样品

4、就会与SDS结合形成带负电荷复合物，而SDS作为一种变性剂和助溶剂，它能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键，并结合到蛋白质分子上，使分子去折叠，破坏蛋白质分子内的二级和三级结构，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。另外，SDS－蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，可打开蛋白质分子内或肽链间的二硫键，并能避免重新氧化，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。蛋白质亚基的电泳的迁移率主要取决于亚基的相对分子质量大小，而电荷的因素可以忽略。8、蛋白质亚基相对分子质量的测方法在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时，蛋白质－SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不

5、同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只主要取决于它的椭圆棒的长度即蛋白质的相对分子质量的大小，而其他因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。由于蛋白质的相对分子质量不同，所形成复合物的相对分子质量不同，在电泳中反映出不同的迁移率。当蛋白质或亚基的相对分子质量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈直线关系，符合下列方程式：lgMr=K－bRf式中Mr代表相对分子质量，K代表常数，b代表斜率，Rf代表迁移率。若将

6、已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得蛋白质相对分子质量。三、实验材料和试剂1、实验材料：蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）2、实验试剂：(1)30.8%凝胶贮液：丙烯酰胺(Acr)30g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加水溶解，并加水定容到100ml，过滤。贮于棕色瓶，可在4℃保存一个月。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物，要小心操作。(2)分离胶缓冲液：3mol/LTris-HClpH8.9(3)浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTris-HClpH6.7(

7、4)10%SDS(5)TEMED(N,N,N′,N′－四甲基乙二胺）(增速剂）(6)10%过硫酸铵（引发剂）(7)电泳缓冲液（pH8.3）：Tris6g，甘氨酸28.8g，SDS2g，用蒸馏水溶解并定至1000ml,使用时稀释1倍。(8)蛋白质样品溶解液（2×蛋白质样品溶解液）：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LTris-HClpH8.0缓冲液。(9)染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250，加90.8ml50%甲醇，加9.2ml乙酸，溶解混匀后使用。(10)脱