实验29氨基移换反应的定性鉴定

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1、实验29氨基移换反应的定性鉴定一、冃的1•学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理。2.了解氨基移换作用在中间代谢中意义3进一步掌握纸层析的原理和操作技术。二、原理氨基移换酶也称转氨酶。它能催化a一氨基酸的a一氨基与一a酮酸的a一酮基互换，这种作用称氨基移换作用。转氨酶的种类甚多，任何一种氨棊酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的最适pH接近7.40在各种转氨陆中，以谷氨酸一•草酸乙酸转氨酚（简称谷草转氨酶，GOT）及谷氨酸一丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶，GPT）活力最强，其催化反应如2COOHCOOHCOOHCooH2H—cl2H—cl2H—cl2H—clCH2h-c-n

2、h2C=OH3=oCIC—+hc-nh2ICooHCOOHCOOH谷氨酸草酰乙酸a-酮戊二酸COOH1COOH1ch2ch2ch2111GOTvch21+c=o1<>CH2H-C-NHo1COOHc=o1COOHCOOH谷氨酸丙酮酸a■酮戊二酸COOH天冬氨酸CH3I+H-C-NH2ICOOH丙氨酸测定转氨腮活性的方法很多，如分光光度法，纸上层析法及光电比色法等。本实验利用纸上层析法，检查市谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作川下所牛成的丙氨酸，证明纽织内氨基移换作用。为了防止丙酗酸被纟R织屮其它酶所氧化或还原，可加入碘乙酸或溟乙酸以抑制酵解作用或氧化作用。三、材料、试剂和器具（一）材料饥饿

3、16小时实验动物一家兔（二）试剂1、1%谷氨酸溶液（用1%KOH溶液中和至中性）2、0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）3、1%丙酮酸溶液（用1%KOH溶液屮和至屮性）4、0.1%碳酸氢钾溶液5、0.05%碘乙酸溶液6、0%乙酸7、标准丙氨酸溶液（0.5%）8、标准谷氨酸溶液（0.5%）9、（）.1%水合前三酮乙溶液10、酚溶剂：在大烧杯中，加蒸憎水40毫升，再加入新蒸锚的无色的苯酚150克，在水浴中加热搅拌，混合至苯酚完全溶解。将该溶液倒入盛有120毫升蒸憎水的500毫长分液漏斗内，轻轻振荡混合，使其成为乳状液。静置7〜10小时，乳状液变成两层透明的溶液，下层为水饱和的酚溶液

4、（即酚溶液）放出卜-层贮存于棕色试剂瓶备用。（三）器具1、解剖刀、剪刀及锻子、匀浆器2、圆规、铅笔、直尺3、毛细管4、电吹风机5、恒温水浴6、滤纸、培养皿7、电动离心机四、操作步骤（一）酶液的制备将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。用表而皿称取1.5克肝脏，放入匀浆器中，加3毫升磷酸缓冲液，研磨成浆，在2500转/分的条件下离心5分钟，取上清液即为酶液。（二）酶促反应：取2支干净试管，按下表加入试剂。试剂f1（待测）2（对照）l%mol/L谷氨酸溶液（滴）10101%丙酮酸钠溶液（滴）10101/15MpH7.4磷酸缓冲液（ml）220.05%碘乙酸（滴）55酶液（滴）20

5、0.05%碘乙酸（滴）30%乙酸（滴）—5（立即滴加并摇匀）煮沸（min）—5将1、2号试管摇匀，置于37°C恒温水浴中保温30min30%乙酸（滴）5—再将1、2号管置于沸水中加热lOmin,使蛋白质沉淀。取出后在流水下冷却，过滤分别收取滤液备用。（三）纸上层析法检杏収15厘米直径的园形层析泸纸一张，在圆心处用圆规划一3厘米直径的同心园，通过中心将滤纸划成四等分，用0.1厘米粗的毛细管分别吸取上述滤液和标准谷氨酸和内氨酸溶分别点在小圆周上，点样直径（）.3厘米，待点样斑点干燥示再点样，如此重复3〜4次。在滤纸的圆心上明一小孔直径约1~2毫米，另取一滤纸小条将其下端剪成刷状，卷成“灯芯

6、”插入屮心小孔，但不使灯芯突出纸面。然后将圆形滤纸平放在盛有层析溶剂的培养皿中，使“灯芯”向下接触溶剂，另一大小相同的培养皿盖在滤纸上（如图29）。此时溶剂经过灯芯上升到纸上向四周扩散，直到溶液移动到距纸边1厘米处，打开培养皿上盖，取出滤纸，拔去灯芯，用吹风筒吹干，然后喷上前三酮溶液，在6（）°C烘10〜15分钟，或川吹风筒的热风吹干，滤纸上即可看到紫红色的氨基酸斑点，计算出各斑点的心值。分析比较层析图谱，确定各点的氨基酸组成，并解释。图29-1园形层析示意图五、注意事项1、提取酶液中，肝脏最好用缓冲液把血块洗去，然后再剪碎研磨，肝与缓冲液的比例-•般为1：3（W/V）左右较为适合。2

7、、把滤纸下端剪成刷状，以增加滤纸毛细管现象以便均匀吸取溶剂，灯芯不能突出纸面，是为了使溶剂的扩展均匀，不致影响层析结果。，六、实验报告附上层析结果图谱，并解释结果七、思、考题1.什幺叫氨基移换作用？说明该作用的特点及其在中间代谢中的意义。2.回顾你所做过的生化实验，对于了解生物体组织代谢实验的特点冇什么认识?