浙江大学生物化学甲实验课件实验9氨基移换反应及其产物的鉴定

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1、实验九氨基移换反应及其产物的鉴定丁鸣一、实验目的和要求1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；2、学习纸层析的原理和操作技术。二、实验基本原理1.氨基移换反应：在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发生的互换反应。转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。转氨酶的最适pH接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性最强。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（glutamicpyruvictransaminase,

2、GPT）、谷草转氨酶（glutamicoxalacetictransaminase,GOT）活性较高。GPT催化下的转氨基反应为：L－谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L－谷氨酸氧化脱－NH2，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L－谷氨酸。本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和α—酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（GPT)的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。2.纸层析原理：滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。

3、层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：原点溶剂前沿样品层析斑点XY⊙●X——原点到层析斑点中心距离Y——原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与样品的性质、结构、溶剂系统（溶剂的性

4、质、溶剂的pH）、层析的温度和层析滤纸有关。此外，样品中的盐分，其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的R基团的化学结构或极性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸样品的分离图谱。3.茚三酮的显色原理：氨基酸+茚三酮类紫红色复合物80℃三、实验材料与试剂1、实验材料动物肝脏(牛蛙肝或猪肝）2、实验试剂⑴0.01mol/L磷酸

5、缓冲液（pH7.4）（转氨基反应所需缓冲溶液）；⑵0.1mol/Lα－丙氨酸（pH7.4）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）；⑶0.1mol/Lα－酮戊二酸（pH7.4）（转氨基反应的底物）；⑷0.1mol/L谷氨酸（pH7.4）（纸层析的标准样品）；⑸展层溶剂－酚溶液：水饱和酚：冰乙酸（300：1）（纸层析用）；⑹10％三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）；⑺0.25%碘乙酸（抑制L－谷氨酸脱氢酶活性）；⑻显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。四、实验器材与仪器⑴研钵；⑵试管及试管架；⑶恒温水浴箱（37℃、100

6、℃）；⑷铅笔、尺和圆规；⑸毛细管（直径0.5mm)；⑹新华定性滤纸（直径11cm）；⑺剪刀和镊子；⑻电吹风；⑼滴管；⑽康氏皿；⑾喷雾器；⑿烘箱（80℃）。五、实验操作方法和步骤1、转氨酶液的制备取新鲜牛蛙肝或猪肝约3g，剪碎用研钵将肝脏碾碎，加3ml磷酸缓冲液迅速碾磨，加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集浆液或滤液即得转氨酶提取液备用。2、氨基移换反应取4支洁净、干燥的试管，按表1操作管号试剂、操作1234转氨酶提取液（ml）11110.25%碘乙酸（ml）0.50.50.50.5预温滴加10％三氯乙酸溶液2滴，100℃×5min置

7、37℃恒温水浴保温5min0.1mol/Lα－丙氨酸pH7.4（ml）1110.1mol/Lα－酮戊二酸pH7.4（ml）1110.01mol/L磷酸缓冲液pH7.4（ml）1221酶促反应混匀，置37℃恒温水浴保温40min（经常摇动）终止酶反应滴加10％三氯乙酸溶液2滴，置100℃恒温水浴保温5min表15.5cm1cm用铅笔作出点样位置用铅笔尖在圆心处截一小孔3、层析⑴准备：①取新华定性滤纸（直径11cm）一张，找出圆心，用圆规画一直径2cm的细圆圈（保持干净），并按图1用铅笔作出点样位置。找出圆心，用铅笔尖在圆心处截一小孔（孔径

8、约0.2cm)。②另取2cm×3cm滤纸，先将下端剪成须状，卷成“灯芯”，备用。2cm3cm⑵点样：用毛细管依次点标准α－丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)各点2次，其余1－4号管样液各点2～3次。点样时，